Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒

简要概述

Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒提供了基于荧光的测定法，用于使用流式细胞仪检测细胞内钙动员。它可以用于动力学读数或终点读数。将Calbryte 520 AM染料加载到细胞中后，只需洗涤细胞并添加钙通量激动剂，即可通过流式细胞仪使用动力学读取模式或终点读取模式读取样品。 Calbryte 520 AM可以通过扩散被动地穿过细胞膜。一旦进入细胞内部，Calbryte 520 AM的亲脂性封闭基团就会被酯酶裂解，产生带负电荷的荧光染料，并留在细胞内部。与钙结合后，其荧光大大增强。当用激动剂刺激表达目的GPCR的细胞时，受体会发出释放细胞内钙的信号，这会明显增加Calbryte 520的荧光。Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒也可用于检测细胞钙通量作为细胞分选。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 钙检测流式细胞仪分析检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 在测定缓冲液中准备细胞

2. 添加Calbryte 520 AM染料加载溶液（1 µL）

3. 在37°C孵育30分钟

4. 清洗细胞

5. 添加钙通量激动剂

6. 在530/30 nm滤光片（FITC通道）使用流式细胞仪检测荧光强度

溶液配制

储备溶液配制

Calbryte 520 AM储备溶液（500X）：在Calbryte 520 AM储备溶液（组分A）的小瓶中加入100 µL DMSO（未提供），并充分混合。 注意：100 µL Calbryte 520 AM储备溶液足以进行100次测定。 如果试管密封严密，可以将未使用的Calbryte 520 AM原液分装并在<-20°C下保存超过一个月。 避光并避免重复的冻融循环。

实验步骤

1.除去细胞培养基，并加入0.5 mL测定缓冲液。注意：对于贴壁细胞和非贴壁细胞，建议分别使用4 x 10⁵ – 8 x 10⁵和1 x 10⁶-2 X 10⁶。每个细胞系应根据个体情况进行评估，以确定细胞内钙动员的细胞密度。

2.将1µL Calbryte 520 AM储备溶液（500X）加到0.5 mL非标准或贴壁细胞的测定缓冲液（组分B）中。注意：如果细胞（例如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，则可将丙磺舒（组分C）添加到染料工作溶液中（ 终孔浓度将为0.125-1 mM），以减少去离子水的泄漏。

3.将细胞在37°C下孵育30分钟。

4.对于非贴壁细胞，将细胞离心并去除染料。将细胞重悬于0.4 mL HHBS（组分D）中。对于贴壁细胞，使用0.5 mM EDTA轻轻地将细胞从板中提起并离心。将细胞重悬于0.4 mL HHBS（组分D）中。注意：要从板上分离贴壁细胞，可以考虑使用酶试剂（例如胰蛋白酶，Accutase），但需要进行测试以确保细胞表面上的目标受体不受影响。

5.用HHBS或所需的缓冲液制备5X激动剂化合物。

6.使用530/30 nm滤光片（FITC通道）在流式细胞仪上检测，在添加100 µL制备的激动剂之前和之后分析样品。注意：为获得结果，重要的是在添加激动剂后1分钟内进行测定。确保激动剂添加到实际读数开始之间的时间对于所有样品保持恒定。

图示

图1.通过Cell Meter 流式细胞钙测定试剂盒在CHO-K1细胞中测量了ATP诱导的细胞内钙释放。将细胞与Calbryte 520 AM染料在37°C下孵育30分钟，然后向细胞中添加10μM的ATP， 在加入ATP后，获得基线并分析其余细胞。这种反应是随着时间的推移而测量的。分析在NovoCyte 3000流式细胞仪上进行。图表上的箭头表示添加ATP和实际分析之间的时间（30秒）。

通过Cell Meter 流式细胞钙测定试剂盒在CHO-K1细胞中测量了ATP诱导的细胞内钙释放。将细胞与Calbryte 520 AM染料在37°C下孵育30分钟，然后向细胞中添加10μM的ATP， 在加入ATP后，获得基线并分析其余细胞。这种反应是随着时间的推移而测量的。分析在NovoCyte 3000流式细胞仪上进行。图表上的箭头表示添加ATP和实际分析之间的时间（30秒）。B.荧光信号随时间的变化。

Cell Meter 比色细胞细胞毒性检测试剂盒

简要概述

Cell Meter 比色法细胞毒性检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于细胞毒性检测的试剂盒，Cell Navigator荧光成像试剂盒是一类荧光成像工具，用来标记亚细胞，细胞器；例如细胞膜、溶酶体、线粒体和细胞核等。Cell Navigator系列细胞器或亚细胞结构标记试剂盒提供 全的细胞及相关细胞器荧光标记方案，每种检测方案均能提供蓝色/绿色/红色/橙色等不同荧光检测方法。这种 的细胞标签为从空间上和时间上研究发生的细胞活动提供了一种十分有效的方法。Cell Meter比色法细胞毒性检测试剂盒 使用可溶于水的四唑染料。在电子载体（PMS）存在的细胞还原性条件下，该染料能产生水溶性的甲瓒。四唑盐经细胞脱氢酶变成橙色的甲瓒产物，它在培养基是可溶的。一定数目甲瓒产物与一定数目活细胞成比例。我们的试剂盒比其他基于四唑细胞毒性检测试剂盒（如MTT、XTT）提供更强有力操作方案。不需要预混合，我们试剂盒四唑盐染料直接加入细胞。此外，我们的试剂盒比其他四唑细胞毒性检测试剂盒（如MTT、XTT）具有高的灵敏度。能广泛的使用多种设备平台。适应于多种的研究，例如细胞粘附、细胞趋化、多耐药性、细胞生存能力、凋亡和细胞毒性等。该试剂盒具备的组分和实验操作流程，适合于增殖或者不增殖的细胞，并能用于悬浮细胞或者贴壁细胞。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 比色法细胞毒性检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.用测试化合物（100μL/孔/ 96孔板或50μL/孔/ 384孔板）制备细胞
2.添加1/5体积的分析溶液（组分A）
3.将细胞在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1-24小时
4.监测A570nm / A605nm的吸光度比

操作步骤

1.在具有黑色壁和透明底部的组织培养微孔板中每孔100至10,000个细胞。 将测试化合物添加到细胞中，并在37℃，5％CO 2培养箱中孵育所需的一段时间（例如24,48或96小时）。 对于空白孔（没有细胞的培养基），加入相应量的化合物缓冲液。 对于96孔板，建议的总体积为100μL，对于384孔板，建议的总体积为50μL。

2.对照设置
2.1阳性对照：含有细胞和已知的增殖或细胞毒性诱导剂。

2.2阴性对照：含有细胞但不含有测试化合物。

2.3载体对照：含有细胞和用于递送测试化合物的载体。

2.4非细胞对照：含有不含细胞的生长培养基。

2.5测试化合物对照：含有用于递送测试化合物[Hank’s平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）]和测试化合物的载体对照。 一些测试化合物具有强自发荧光并且可能产生假阳性结果。 注意：对于96孔板，将所有对照的总体积与100μL匹配，对于具有生长培养基的384孔板，将所有对照的总体积与50μL相匹配。

3.将测定溶液（组分A）预热至37°C。 在开始实验之前彻底混合。

4.向每个孔中加入20μL（96孔板）或10μL（384孔板）的测定溶液（组分A）。 轻轻摇动平板30秒，混合试剂。

5.将细胞在37°C，5％CO₂培养箱中孵育1-24小时，避光。 注意：适当的孵育时间取决于单个细胞类型的代谢率和使用的细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。 不推荐极长的孵育时间，因为指示剂可以转化为无色化合物。

6.用吸光度读板仪在OD比率A570nm / A605nm下监测吸光度的增加。 OD₅₇₀与OD₆₀₅的比率用于确定每个孔中的细胞活力。 注意：细胞存活率与OD₅₇₀增加和OD₆₀₅减少成正比。

数据分析

        从含有细胞的那些孔的值中减去从非细胞对照孔读取的背景吸光度。注意：空白孔的背景吸光度可以根据生长培养基或微量滴定板的来源而变化。

        每个孔中的吸光度读数表示孔中的细胞数。

根据以下公式计算样品和对照的细胞活力百分比：
％细胞活力= 100×（Rsample – Ro）/（Rctrl – Ro）
Rsample是在测试化合物存在下OD570 / OD605的吸光度比。
Rctrl是不存在测试化合物（载体对照）时OD570 / OD605的吸光度比。
Ro是OD570 / OD605的平均背景（非细胞对照）吸光度比。

        从空白标准孔获得的读数（Abs）用作阴性对照。从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。该等式可用于计算细胞数/孔样品。

图1.用Cell Meter 比色细胞细胞毒性测定试剂盒测量CHO-K1细胞数量反应。 将1至10个细胞/孔/100μL的CHO-K1细胞在Costar黑壁/透明底96孔板中接种过夜。 将细胞与20μL/孔的测定溶液（组分A）在37℃下孵育3小时。用SpectraMax plus（Molecular Devices）在570nm和605nm下测量吸光度强度。 OD570 / OD605的比例与所示的细胞数成比例。

Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 适合微孔板检测

                
简要概述

        Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 适合微孔板检测 是美国AAT Bioquest研发的用于检测线粒体膜电位的试剂盒，JC-1在许多实验室中被广泛使用，但其水溶性差导 大的不便。即使在1μM浓度下，JC-1也倾向于在水性缓冲液中沉淀。当需要高染料浓度时，JC-10被开发成为JC的优异替代品。与JC-1相比，JC-10具有更好的水溶性。 JC-10能够选择性地进入线粒体，并随着膜电位的增加可逆地将其颜色从绿色变为橙色。该性质是由于膜极化时JC-10聚集体的可逆形成导致发射光从520nm（即JC-10单体形式的发射）向570nm（即J-聚集体形式的发射）的移动。当在490nm处激发时，随着线粒体膜变得更加极化，JC-10的颜色从绿色橙色可逆地变为绿色橙色。使用通常安装在所有流式细胞仪中的过滤器可以检测两种颜色。可以在荧光通道1（FL1）中分析绿色发射，在通道2（FL2）中分析绿色橙色发射。除了用于流式细胞仪外，它还可用于荧光成像和荧光微孔板平台。这种Cell Meter 线粒体膜电位检测试剂盒使研究人员能够以酶标仪的形式运行JC-10检测，并为监测线粒体膜电位变化提供了 强大的检测方法。
        这种Cell Meter JC-10线粒体膜电位检测试剂盒使研究人员能够以酶标仪的形式运行JC-10检测，并为监测线粒体膜电位变化提供了 可靠的检测方法。该试剂盒基于阳离子亲脂性JC-10染料检测细胞中线粒体膜电位的变化。在正常细胞中，JC-10浓缩在线粒体基质中，在那里形成红色荧光聚集体。然而，在凋亡和坏死细胞中，JC-10扩散出线粒体。它变成单体形式并以绿色荧光染色细胞。该试剂盒可用于筛选凋亡激活剂和抑制剂。可以以方便的96孔和384孔荧光微量滴定板形式进行测定。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的线粒体膜电位荧光探针。

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产品说明书

96孔板样品分析

概述

准备细胞

添加测试化合物

添加JC-10染料加载溶液（50μL/孔/ 96孔板或12.5μL/孔/ 384孔板）

在37℃，5％CO2培养箱中孵育30至60分钟

添加测定 缓冲液B（50μL/孔/ 96孔板或12.5μL/孔/ 384孔板）

在Ex / Em = 490/525和540/590 nm处监测荧光强度

操作步骤

1.准备细胞：
1.1对于贴壁细胞：在生长培养基中将细胞以20,000至80,000个细胞/孔/90μL过夜，96孔板或5,000至20,000个细胞/孔/20μL，用于384孔板。
1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于100,000-200,000细胞/孔/90μL的培养基中，用于96孔poly-D赖氨酸平板或25,000-50,000细胞/孔 /20μL，用于384孔聚-D赖氨酸板。 在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。
注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。

2.准备JC-10染料加载溶液：
2.1使用前在室温下清洗所有套件组件。
2.2将50μL100XJC-10（组分A）加入5mL测定缓冲液A（组分B）中，充分混合。
注意：将未使用的100X JC-10（组分A）等分并保存在-20 oC。 避免反复冻/融循环。

3.运行JC-10测定：
3.1通过向所需缓冲液（例如PBS或HHBS）中加入10μL10X测试化合物（96孔板）或5μL5X测试化合物（384-板）来处理细胞。
注意：在添加化合物之前不必洗涤细胞。然而，如果测试的化合物对血清敏感，则可在添加化合物之前吸出生长培养基和血清因子。在抽吸后将相同体积的HHBS添加到孔中（例如对于96孔板为90μL或对于384孔板为20μL）。或者，细胞可以在无血清培养基中生长。
3.2在室温或37℃，5％CO2培养箱中培养细胞板至少15分钟或所需的时间（对于Jurkat细胞，用喜树碱4-6小时或用星形孢菌素处理3-5小时）到诱导细胞凋亡
3.3将50μL/孔（96孔板）或12.5μL/孔（384孔板）的JC-10染料加载溶液（来自步骤2.2）加入细胞板（来自步骤3.2）。
3.4将染料加载板在37℃，5％CO2培养箱中孵育30-60分钟，避光。
注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。
3.5在读取荧光强度之前，将50μL/孔（96孔板）或12.5μL/孔（384孔板）的测定缓冲液B（组分C）加入染料加载板（来自步骤3.4）。
注1：装载后请勿清洗电池。
注2：对于非粘附细胞，建议在加入分析缓冲液B（组分C）后，以800rpm离心细胞板2分钟，同时停止制动。
3.6使用底部读取模式监测Ex / Em = 490 / 525nm（在515nm处截止）和540 / 590nm（在570nm处截止）的荧光强度以进行比率分析。

数据分析

Em在525/590处的荧光强度比率用于数据分析。

图1.在Jurkat细胞中用JC-10和JC-1测量了喜树碱诱导的线粒体膜电位变化。 用喜树碱（10mM）处理Jurkat细胞4小时后，向孔中加入JC-1和JC-10染料上样溶液并孵育30分钟。 使用NOVOstar酶标仪（BMG Labtech）在Ex / Em = 490 / 525nm和490 / 590nm下测量J-聚集体和单体形式的JC-1和JC-10的荧光强度。

Cell Meter™细胞粘附测定试剂盒

简要概述

Cell Meter™细胞粘附测定试剂盒是一种快速灵敏的测定方法，用于测量多种细胞类型的细胞-细胞或细胞表面粘附力。在该测定中，将细胞用钙黄绿素UltraGreen AM标记并使其贴壁。去除非贴壁细胞后，使用钙黄绿素UltraGreen的荧光来计算贴壁细胞的数量。使用我们的荧光染料Calcein UltraGreen AM，可以提供一种快速而灵敏的方法来测量多种细胞类型的细胞粘附性。钙黄绿素UltraGreen AM是无荧光的，但一旦加载到细胞中，就会被内源性酯酶裂解，产生高荧光的钙黄绿素UltraGreen，这是一种荧光强，不依赖pH值的细胞质细胞标记，对细胞粘附过程的干扰小。Cell Meter™细胞粘附测定法设计用于荧光酶标仪。

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产品说明书

样品分析方案

概述

添加细胞

在37°C下孵育细胞使其贴壁

去掉未贴壁细胞

添加Calcein Ultragreen AM工作溶液

在37°C下孵育细胞20-30分钟

去除上清液并用HHBS或DPBS洗涤细胞

使用荧光酶标仪（Ex / Em = 490/525 nm）检测荧光强度 

储备溶液配制

钙黄绿素超绿AM储备溶液
向Calcein Ultragreen AM（组分A）中加入50 µL DMSO（组分C）并充分混合。
注意：将未使用的Calcein Ultragreen AM储备溶液分装在-20°C下，一次性使用，以免冻融循环。

工作溶液配制

钙黄绿素超绿AM工作溶液
将50 µL钙黄绿素Ultragreen AM储备溶液添加到10 mL粘附测定缓冲液中，并充分混合。
注意：不应储存Calcein Ultragreen AM工作溶液，应立即使用。
注意：10 mL Calcein Ultragreen AM工作溶液足以进行100次测试。

操作步骤

以下方案可用作指导，应根据需要进行优化。

1. 在涂有所需试剂的板上添加100 µL体积的细胞。

2. 在37°C下孵育平板2至3小时。
   注意：对于每种细胞系，孵育时间应通过实验进行测试。

3. 除去生长培养基和未贴壁的细胞。

4. 加入100 µL钙黄绿素Ultragreen AM工作溶液，并在37°C下孵育平板20-30分钟。
   注意：对于每种细胞系，孵育时间应通过实验进行测试。

5. 除去染料工作溶液，并用1X Hank盐溶液和20 mM Hepes缓冲液或DPBS洗涤细胞一次。

6. 在孔中加入100 µL粘附测定缓冲液。

7. 使用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）处检测荧光强度。 

图示

图1.在荧光酶标仪中使用Cell Meter™细胞粘附测定试剂盒测量的细胞粘附。将不同程度的Jurkat细胞在加有不同试剂的孔中孵育，然后在37°C下用Calcein Ultragreen AM染色30分钟。在Ex / Em = 490/525 nm处检测信号。

Cell Meter 抗氧化活性检测试剂盒

简要概述

        Cell Meter 抗氧化活性检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测ROS的试剂盒，活性氧（ROS）在细胞信号传导和维持生理细胞代谢中是重要的。 过量的ROS损害细胞成分，这些成分与多种疾病相关，包括癌症，代谢紊乱，神经退行性疾病等。产生抗氧化剂，包括酶，大分子和小分子，以对抗ROS诱导的生物体内的损伤。 体液，组织和细胞中抗氧化活性的定量分析提供了重要的生物信息。 我们的Amplite™比色抗氧化检测试剂盒使用ABTS作为抗氧化活性的比色指示剂，基于观察到抗氧化剂能够阻止ABTS氧化的能力 ABTS +通过辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢（H2O2）ABTS +，一种可溶性色原，可以在405nm处用分光光度法监测。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 抗氧化活性检测试剂盒。 

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样品实验方案

简要概述

1.准备样品/ Trolox（10 µL）
2.添加HRP（20 µL）
3.添加ReadiUse ABTS底物溶液（150 µL）
4.在室温下孵育5分钟
5.监控405 nm处的吸光度

溶液配制

1.储存溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 辣根过氧化物酶（HRP）储备溶液（2000X）：
向辣根过氧化物酶（组分A）的小瓶中加入1 mL分析缓冲液（组分B）。

1.2 Trolox标准溶液（100毫米）：
将100 µL DMSO加到Trolox瓶中（组分D）。

2.标准溶液配制

Trolox标准
通过使用稀释因子= 2和高浓度= 1 mM在测定缓冲液（Componenet B）中稀释100 mM Trolox标准溶液来制备Trolox标准溶液。

3.工作溶液配制

将2.5 uL的2000X HRP储备溶液添加到5 mL的测定缓冲液（组分B）中，制成1X HRP工作溶液。

样品操作及实验分析

表1.在透明的96孔微孔板中的Trolox标准品和测试样品的布局。 SD = trolox标准品（SD1-SD7，0.0156至1 mM），BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和表1中的布局，准备trolox标准品（SD），空白对照（BL）和测试样品（TS）（如有必要，在测定缓冲液中稀释样品，使抗氧化剂水平与Trolox处于同一范围内），表2。

2.在Trolox标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入20 µL HRP工作溶液，使总体积为30 µL /孔。

3.向每个孔中加入150 µL ReadiUse ABTS底物溶液（组分C），总体积为180 µL /孔。 注意：避免光照，并在聚丙烯容器中使用。

4.在室温下孵育5分钟。 注意：这5分钟的保温时间是一个指导原则。 可以改变孵育时间以获得更合适的吸光度。

5.使用酶标仪读取405 nm处的吸光度。

Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒

简要概述

        Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于线粒体检测的试剂盒，细胞内羟基自由基的检测对于理解适当的细胞氧化还原调节及其失调对各种病理的影响至关重要。羟基（HO·）是与其他分子高度反应的活性氧（ROS）之一，以实现稳定性。通常，羟基被认为是氧化代谢的有害副产物，其可以在生命系统中引起分子损伤。它显示平均寿命为10-9秒，可以与几乎所有生物分子如核DNA，线粒体DNA，蛋白质和膜脂质发生反应。 AAT Bioquest的Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒经过优化，可用于检测线粒体中的ROS。 MitoROS OH580是活细胞渗透探针，可以快速和选择性地靶向活细胞中的羟基自由基。当它与OH·反应时产生红色荧光，并且可以在Ex / Em = 540 / 590nm处容易地读取。 Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒提供灵敏的荧光探针，可在孵育1小时后检测活细胞中的OH·。该试剂盒可用于荧光酶标仪和荧光显微镜应用。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒。 

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96孔板分析示例

概述

准备细胞用MitoROS OH580工作溶液

在37ºC孵育细胞60分钟

用测试化合物孵育细胞（诱导OH·）

在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光增加

注意：使用前在室温下解冻所有组件。

操作步骤

1.准备细胞：

1.1对于粘附细胞：在生长培养基中将细胞过夜，10,000至40,000个细胞/孔/90μL用于96孔板或2,500至10,000个细胞/孔/20μL用于384孔板。

1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，将细胞沉淀悬浮于培养基中，100,000-200,000细胞/孔/90μL，96孔poly-D赖氨酸平板或25,000-50,000细胞/孔/ 对于384孔聚-D赖氨酸板，20μL。 在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。

注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定细胞密度。

2.准备MitoROS OH580方案：

2.1Prepare MitoROS OH580储备液（500X）：将50μLDMSO（组分C）加入MitoROS OH580（组分A）的小瓶中，并充分混合。

注意：25μL重组的MitoROS OH580原液足以容纳1个平板。 如果管子密封并且避光，可以将未使用的部分等分并在≤-20℃下储存超过一个月。避免反复冻融循环。

2.2准备MitoROS OH580工作溶液：将25μL500XDMSO重构的MitoROS OH580储备溶液（来自步骤2.1）加入10 mL分析缓冲液（组分B）中，并充分混合。 该工作溶液在室温下稳定至少2小时。

3.运行羟基自由基测定：

3.1取出培养基，加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的MitoROS OH580工作溶液（步骤2.2）到细胞板中。将细胞在37ºC孵育1小时。

3.2为了诱导羟基自由基，用37℃的所需缓冲液（如PBS或HHBS）中的文本化合物处理细胞一段所需的时间，避光。

注意1：我们用芬顿反应（10μMCuCl2和100μMH2O2）在37℃处理HeLa细胞1小时，以诱导外源性羟基自由基。详细信息请参见图1。

注意2：我们用生长培养基中的PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯）在37℃下处理RAW 264.7细胞4小时，以刺激内源性羟基自由基。详细信息请参见图2。

3.3用HHBS或DPBS将细胞洗涤2-3次，并向每个孔中加入100μL测定缓冲液（组分B）。

3.4使用具有TRITC滤光片组的荧光显微镜观察细胞中的荧光信号，或使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540 / 590nm（截止= 570nm）下以底部读取模式测量荧光增加。

数据分析

图1.使用MitoROS OH580（Cat＃16055）在HeLa细胞中测量羟基自由基的荧光图像。 将HeLa细胞与MitoROS OH580工作溶液在37℃下孵育1小时，然后用HHBS洗涤一次。 芬顿反应：然后将细胞用10μMCuCl2和100μMH2O2在1X HBSS缓冲液中于37℃处理1小时。 对照：将HeLa细胞保持在1X HBSS缓冲液中而不进行处理。 用HHBS洗涤3次后，使用具有TRITC过滤器组（红色）的荧光显微镜测量HeLa细胞。 细胞核用Hoechst 33342（Cat＃17530，Blue）染色。

图2.使用MitoROS OH580（Cat＃16055）检测RAW 264.7细胞中的细胞内羟基自由基。 将细胞与MitoROS OH580工作溶液在37℃下孵育1小时，然后用HHBS洗涤一次。 然后将细胞在没有或与PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，10-500ng / mL）在生长培养基中于37℃温育4小时。 用HHBS洗涤3次后，使用具有TRITC过滤器组的荧光显微镜测量HeLa细胞。

Cell Meter 钙检测免洗和免丙磺舒检测试剂盒*适用于酶标仪*

简要概述

        Cell Meter 钙检测免洗和免丙磺舒检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测葡萄糖的试剂盒，Cell Meter 无洗涤和无丙磺舒钙测定试剂盒可实现均相荧光测定，用于检测细胞内钙动员，无需使用动力学读数模式。它可用于具有底部读取模式的荧光酶标仪，其没有内置液体分配器或动力学读数的能力。将Fluo-8E AM染料加入感兴趣的细胞后，无需洗涤步骤，可以通过液体分配器或手动移液器简单地添加钙通量激动剂，然后通过荧光读数器在Ex / Em = 490 /读取板525纳米。 Fluo-8E AM可通过扩散被动地穿过细胞膜。一旦进入细胞内，Fluo-8E AM的亲脂性阻断基团被酯酶切割，产生带负电荷的荧光染料，留在细胞内。它的荧光大大增强，并且在与钙结合后持久。当用激动剂刺激表达目的GPCR的细胞时，该受体发出细胞内钙的释放信号，这显着增加了Fluo-8E 的荧光。其高灵敏度，> 100倍荧光增强和持久荧光信号的特性使Fluo-8E 成为荧光酶标仪上细胞钙测量的理想指标，不具备流体转移和动态读数模式的能力。 Cell Meter 无洗涤和无丙磺舒的终点钙测定试剂盒可以96孔或384孔板进行实验。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 钙检测免洗和免丙磺舒检测试剂盒。 

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产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.在生长培养基中准备细胞
2.添加Fluo-8E AM染料加载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）
3.在37°C孵育60分钟
4.加入50 µL钙通量刺激剂
5.监测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 Fluo-8E AM储备方案：
在Fluo-8E AM（组分A）小瓶中加入10 µL DMSO，并充分混合。 注意：10 µL Fluo-8E AM储备溶液足以进行50次测定（96孔板的一半）。 注意：如果试管密封严密，可以将未使用的Fluo-8E AM储备溶液分装并在<-20℃下保存1个月以上。 避光并避免重复的冻融循环。

1.2 分析缓冲液（1X）：
将9 mL的HHBS（组分C）加入10XPluronic®F127 Plus（1 mL，组分B）中，并充分混合。 注意：10毫升测定缓冲液（1X）足以用于一块板。 分装并在<-20°C下存储未使用的1X分析缓冲液。 避光并避免重复的冻融循环。

2.工作溶液

Fluo-8E AM染料：
将10 µL Fluo-8E AM储备溶液添加到5 mL的测定缓冲液（1X）中，并充分混合。 注意：此工作溶液在室温下至少可稳定2小时。

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样品操作及实验分析

1.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Fluo-8E™AM染料加载溶液添加到细胞板中。 不要从细胞板上除去生长培养基。

2.在细胞培养箱中将染料加载板孵育45-60分钟。
 
3.用HHBS或所需的缓冲液准备钙刺激剂溶液（5X）。

4.加入50个准备好的刺激物，并通过底部读取模式通过监测Ex / Em = 490/525 nm处的荧光强度立即运行钙通量测定。 注意：为获得结果，重要的是在添加激动剂后1分钟内进行测定。 确保激动剂添加到实际读数开始之间的时间对于所有样品保持恒定也很重要。

Cell Meter 荧光法细胞内过亚硝酸盐检测试剂盒 适用于流式细胞仪

简要概述

        Cell Meter 荧光法细胞内过亚硝酸盐检测试剂盒 适用于流式细胞仪 是美国AAT Bioquest生产的用于检测亚硝酸盐的试剂盒，过氧亚硝酸盐（ONOO-）是强氧化物质和高活性硝化剂。过氧亚硝酸盐由超氧化物自由基与细胞内产生的NO之间的反应形成。它可以破坏各种生物分子，包括蛋白质，酶，脂质和核酸，导致细胞死亡。同时，过氧亚硝酸盐还可以通过促进针对入侵病原体的宿主防御反应而在体内具有保护活性。因此，过氧亚硝酸盐是涉及广泛的生理和病理过程的必需生物氧化剂。由于其半衰期极短且稳态浓度低，因此检测和了解过氧亚硝酸盐在生物系统中的作用一直具有挑战性。为了解决这一未满足的需求，AAT Bioquest的Cell Meter 荧光细胞内过氧亚硝酸盐（ONOO-）检测试剂盒提供了一种监测活细胞中ONOO水平的灵敏工具。 AAT Bioquest的DAX-J2 PON Green荧光探针，可与细胞间ONOO'发生特异反应，生成亮绿色荧光产品。该试剂盒针对流式细胞仪进行了优化。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 荧光法细胞内过亚硝酸盐检测试剂盒 适用于流式细胞仪 。 

产品说明书

样品实验方案 

简要概述

1.在生长培养基中准备细胞
2.将细胞与测试化合物（刺激ONOO′）和DAX-J2 PON Green工作溶液共同孵育
3.监测Ex / Em = 490/530 nm的荧光强度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 DAX-J2 PON绿色库存解决方案（400X）：
将25 µL DMSO（组分C）添加到DAX-J2 PON Green（组分A）小瓶中，并充分混合。 注意：1 µL的复配DAX-J2 PON Green储备液足以容纳0.4 mL的细胞。

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样品操作及实验分析

1.将DAX-J2 PON Green与测试化合物在完全培养基中或在所需缓冲液中的37°C下共孵育细胞一段时间，并避光。对于对照孔（未处理的细胞），添加相应量的化合物缓冲液。注意：建议用完全培养基染色细胞。但是，如果测试的化合物对血清敏感，则可以在染色前将生长培养基和血清因子吸掉。将细胞悬浮于1X Hank盐溶液和20 mM Hepes缓冲液（HHBS）或抽吸后选择的缓冲液中。或者，可以在无血清培养基中对细胞进行染色。我们将RAW 264.7巨噬细胞与50-200 µM SIN-1和DAX-J2 PON Green在完全培养基中于37°C共同孵育1小时，以诱导亚硝酸盐。有关详细信息，请参见图1（A）。

2.或者，用DAX-J2 PON Green在37°C避光的环境下染色细胞1小时。除去工作溶液，然后在完全培养基中或在所需的缓冲液中于37°C用测试化合物处理细胞所需的时间。有关详细信息，请参见图1（B）。

3.使用流式细胞仪监测FITC通道（Ex / Em = 490/530 nm）的荧光强度。

Cell Meter 线粒体膜电位近红外检测试剂盒 适合微孔板检测

简要概述

我们的Cell Meter 检测试剂盒是一套用于检测细胞生存力的工具。有多种参数可用于检测细胞活力。该特定试剂盒旨在通过测量线粒体膜电位的丧失来监测细胞凋亡。线粒体膜电位的崩溃与线粒体通透性过渡孔的开放相吻合，导致细胞色素C释放到细胞质中，进而触发凋亡级联反应中的其他下游事件。我们的Cell Meter NIR线粒体膜电位检测试剂盒为所有必需成分提供了优化的测定方法，可检测线粒体膜电位丧失的细胞凋亡。该荧光测定法是基于我们专有的阳离子MitoLite NIR 染料对细胞中线粒体膜电位的检测。在正常细胞中，MitoLite NIR 主要在线粒体中积累，但是在凋亡细胞中，MitoLite NIR 染色强度降低。用MitoLite NIR 染色的细胞可以在620-640 nm激发下在660-680 nm荧光下进行检测。该试剂盒可用于筛选凋亡激活剂和抑制剂。该测定可以以方便的96孔和384孔荧光微量滴定板形式进行。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 线粒体膜电位近红外检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 准备细胞

2. 添加测试化合物

3. 添加MitoLite NIR工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板）

4. 在5％CO₂的培养箱中于37°C孵育30-60分钟

5. 添加测定缓冲液B（50 µL /孔/ 96孔板或12.5 µL /孔/ 384孔板）

6. 检测Ex / Em = 640/680 nm（截止= 665 nm）的荧光强度（底部读取模式）

溶液配制

工作溶液配制

将50 µL的200X MitoLite NIR（组分A）添加到10 mL的测定缓冲液A（组分B）中，并充分混合以制成MitoLite NIR工作溶液，避光。

操作步骤

1.用测试化合物处理细胞一段所需的时间，以诱导细胞凋亡并建立平行对照实验。

阴性对照：仅用载体处理细胞。

阳性对照：在37℃，5％CO₂培养箱中，以5-50 µM的浓度用FCCP或CCCP处理细胞15至30分钟。 注意：CCCP或FCCP可以与MitoLite NIR同时添加。 为了获得结果，可能需要为每个单独的细胞系滴定CCCP或FCCP。

2.在添加MitoLite NIR工作溶液之前，请去除细胞培养基。注意：在添加MitoLite NIR工作溶液之前，必须除去细胞培养基。

3.将100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板的MitoLite NIR工作溶液添加到细胞板中。

4.在37°C，5％CO₂的培养箱中避光放置30-60分钟。注意：适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。

5.在检测荧光信号之前，将50 µL /孔/ 96孔板或12.5 µL /孔/ 384孔板的测定缓冲液B（组分C）加入细胞板。注意：加载后请勿洗涤细胞。对于非贴壁细胞，建议在加入测定缓冲液B（组分C）后，以800 rpm离心细胞板2分钟，然后制动。

6.加入测定缓冲液B（组分）10到30分钟后，使用荧光酶标仪（底部读取模式）（Ex / Em = 640/680 nm（Cutoff = 665 nm））检测荧光强度。