Amplite 荧光法胞内辣根过氧化物酶检测试剂盒 绿色荧光
| 货号 |
11503 |
存储条件 |
f/l |
| 规格 |
200 Tests |
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| Ex (nm) |
497 |
Em (nm) |
516 |
| 分子量 |
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溶剂 |
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| 产品详细介绍 |
简要概述
Amplite 荧光法胞内辣根过氧化物酶检测试剂盒 绿色荧光 是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化物的试剂盒，过氧化氢（H2O2）是一种活性氧代谢副产物，可作为许多氧化应激相关状态的关键调节剂。
这种Amplite 荧光过氧化氢测定试剂盒使用我们的非荧光Amplite 绿色过氧化物酶底物来量化溶液和细胞提取物中的过氧化氢。它还可用于通过酶偶联反应检测多种氧化酶活性。该试剂盒是一种优化的“混合和读数”分析，与HTS液体处理仪器兼容。它提供灵敏的一步荧光测定法，可在100μL测定体积（30 nM，图1）中检测少至3皮摩尔的H2O2。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = ~540 / 590 nm的荧光酶标仪或~570 nm的吸光度酶标仪轻松读取。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒。
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产品说明书
96孔板的测定方案
概述
准备H2O2反应混合物（50μL）
加入H2O2标准品或测试样品（50μL）
在室温下孵育10-30分钟在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光强度
注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。
操作方法
1.准备库存解决方案：
1.1100X Amplite 红色过氧化物酶底物原液：将250μLDMSO（组分E）加入到Amplite 红色底物（组分A）的小瓶中。 应及时使用原液; 任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。
注意：避免反复冻融循环并避免光照。
1.220U / mL过氧化物酶储备溶液：将1mL测定缓冲液（组分C）加入到辣根过氧化物酶（组分D）的小瓶中。
注意：未使用的HRP溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。
1.320mM H2O2储备溶液：将22.7L的3％H2O2（0.88M，组分B）加入977L的测定缓冲液（组分C）中。
注意：稀释的H2O2溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。
2.准备H2O2反应混合物：
3.准备H2O2标准品（0至10μM）的连续稀释液：
注意1：在存硫醇如DTT和β-巯基乙醇的情况下，组分A不稳定。 高于10M（浓度）的硫醇将显着降低测定动态范围。
注意2：NADH和谷胱甘肽（还原形式：GSH）可能会干扰检测。
3.1将1μL20mM H2O2溶液（来自步骤1.3）加入1999μL测定缓冲液（组分C）中，得到10μMH2O2标准品。
3.2取200μL10μMH2O2标准品进行1：3连续稀释，得到3，1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μMH2O2标准品系列稀释液。
3.3如说明书中表2和3中所述，将H2O2标准品和含H2O2的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。
4.在上清液反应中进行H2O2测定：
4.1将50μLH2O2反应混合物（来自步骤2）加入到H2O2标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总H2O2测定体积为100μL/孔。
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLH2O2反应混合物。
4.2在室温下孵育反应15至30分钟，避光。
4.3在Ex / Em = 540±10/590±10nm（Ex / Em = 540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。
注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。
5.对细胞进行H2O2检测：
Amplite 荧光过氧化氢检测试剂盒可用于测量细胞中H2O2的释放。 以下是建议的协议，可以进行修改以满足特定的研究需求。
5.1 H2O2反应混合物应按步骤2制备，但分析缓冲液（组分C）应替换为细胞培养系统中使用的培养基。建议的培养基包括（a）Krebs Ringers磷酸盐缓冲液（KRPB）;（b）汉克斯平衡盐溶液（HBSS）; 或（c）无血清培养基。
5.2在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要激活细胞。
注意：包括阴性对照（单独培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。
5.3将50μLH2O2反应混合物（来自步骤5.1）加入到细胞和H2O2标准品的每个孔中（来自步骤3.3）
5.4在室温下孵育反应15至30分钟，避光。
5.5用Ex / Em = 540±10/590±10nm（Ex / Em = 540 / 590nm）的荧光板读数器监测荧光增加。
