Screen Quest 荧光法葡萄糖摄取检测试剂盒

简要概述

        Screen Quest 荧光法葡萄糖摄取检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于葡萄糖检测的试剂盒，葡萄糖转运系统负责将葡萄糖转运穿过细胞膜。测量组织和细胞中2-葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖（2-DG）的摄取被广泛接受作为估计葡萄糖摄取量和研究葡萄糖代谢的调节和胰岛素抗性机制的可靠方法。 2-DG摄取通常通过使用用氚或C14标记的非代谢的2-DG来确定。然而，常规使用放射性标记的探针是昂贵的并且需要繁琐的特殊处理程序。 AAT Bioquest的Screen Quest 荧光葡萄糖摄取分析试剂盒可在细胞中提供灵敏的非放射性分析。在该测定中，2-DG被葡萄糖转运蛋白吸收，并代谢成（2-DG6P）。不可代谢的2-DG6P在细胞中积累，并且与细胞的葡萄糖摄取成比例。累积的2-DG6P被酶促氧化并产生NADPH，其通过荧光NADPH传感器特异性监测。可以通过荧光酶标仪读取信号。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 荧光法葡萄糖摄取检测试剂盒。 

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.平板细胞并根据需要处理细胞
2.加入10μL/孔2-DG并在37℃下孵育20-40分钟
3.洗涤细胞并裂解细胞
4.加入50μl/孔的2-DG Uptake Assay工作溶液
5.在室温下孵育30至120分钟
6.监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光增加

溶液配制

1.储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
KRPH缓冲液原液（1X）：
将20mL KRPH缓冲液（5X）（组分H）加入到80mL去离子水中并充分混合。 注意：对于大约一个96孔板，50 mL体积的1×KRPH缓冲液就足够了。 按比例准备所需的音量。 将未使用的1×KRPH存放在4ºC或-20ºC。

2.工作溶液配制

1. NADP工作溶液：
将100μLH₂O加入到NADP（组分G）的小瓶中并充分混合。

2.酶探针工作溶液：
将5mL测定缓冲液（组分F）加入酶探针瓶（组分E）中并充分混合。

3. 2-DG摄取分析工作溶液：
将100μL的NADP工作溶液加入酶探针工作溶液中并充分混合。 注意：这些数量适用于一个96孔板。

操作步骤

重要提示：该方案可用作培养3T3-L1脂肪细胞用于2-DG摄取的指导。

1.在生长培养基中以50,000-80,000细胞/孔/100μL/ 96孔或12,500-20,000细胞/孔/25μL/ 384-孔黑壁/透明底细胞培养Poly-D赖氨酸平板培养4-6小时。

2.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）无血清培养基除去细胞。将细胞在37ºC，5％CO₂培养箱中孵育6小时至过夜。

3.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μL/孔1×KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞两次。

4.加入90μL/孔葡萄糖摄取缓冲液（组分B）并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育细胞1小时。

5.用或不用胰岛素或试验化合物刺激20分钟。加入10μL/孔的10×胰岛素溶液至终浓度为1μM或10×化合物测试溶液。并且还向未处理的孔中加入10μL胰岛素载体缓冲液或复合载体缓冲液作为对照，并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育20分钟。

6.对于葡萄糖摄取抑制研究，加入10×Phloretin至终浓度为200 uM或测试抑制剂，并在37ºC，5％CO₂下孵育2-5分钟。注意：建议将10mL抑制剂载体缓冲液加入胰岛素处理和未处理的孔中作为对照。 Phloretin处理的细胞可用作阳性对照。

7.向每个孔中加入10μL/孔2-DG溶液（组分A），并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育20-40分钟。对于阴性对照，留下一些未经胰岛素，抑制剂和2-DG处理的孔。

8.处理后，取出每孔中的溶液，用KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞3次，100μL/孔，从溶液中除去额外的2-DG。从孔中移除KRPH缓冲液。

9.向每个孔中加入25μL/孔酸性裂解缓冲液（组分C），并在37℃下孵育20分钟以裂解细胞。并且可以同时制备2DG摄取测定混合物。

10.向每个孔中加入25μL/孔中和缓冲液（组分D），充分混合，在室温下放置5-10分钟以中和细胞裂解物。

11.向2DG6P标准品或细胞裂解液的每个孔中加入50μL2DGUptake Assay工作溶液。

12.在室温下孵育反应30分钟至2小时，避光。

13.用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的荧光板读数器监测荧光增加（Ex / Em = 540 / 590nm，在570nm处截止）。

数据分析

Screen Quest 荧光法多 抗性MDR检测试剂盒 *1板*

简要概述

肿瘤细胞对细胞 的耐药性被认为是化疗成功的主要障碍之一。有些肿瘤 初是耐药的，对细胞抑制 治疗没有反应；另一些肿瘤 初反应良好，但 终会再生并产生耐药性。这种现象可能是由所给抗肿瘤 诱导的基因突变引起的，也可能代表恶性肿瘤中已存在的耐药细胞群的选择。多药耐药（MDR）是多种化疗失败的主要因素。在过去的几年中，人们普遍认为化疗耐药性与至少两个ATP依赖的 外排的过度表达有关。这些细胞膜蛋白，称为P-糖蛋白（Pgp，MDR1）和多药耐药相关蛋白（MRP1）是ABC转运体家族的成员。我们的检测试剂盒使用荧光MDR指示剂来检测这两种MDR活性。这种疏水性荧光染料分子迅速穿透细胞膜并保留在细胞内。短时间培养后，细胞内游离染料浓度明显增加。在表达MDR1和/或MRP1的细胞中，该染料被MDR转运体挤压，从而降低细胞荧光强度。然而，当其挤压被干扰MDR1和MRP1活性的试剂阻断时，其细胞荧光强度明显增加。我们的MDR检测试剂盒提供了一个优化的检测方法的所有必须成分。该方法可在96孔或384孔微孔板中进行，且易于自动化。该试剂盒是高通量筛选MDR抑制剂或鉴定具有高水平MDR活性细胞的理想试剂盒。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 荧光法多 抗性MDR检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 准备细胞

2. 添加MDR抑制剂或化合物

3. 添加MDR染料加载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）

4. 在室温下孵育1小时

5. 使用底部读取模式检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

溶液配制

储备溶液配制

MDR指示剂储备溶液：将20 µL（#36340-1板）或200 µL（#36341-10板）添加到MDR指示剂（组分A）中，并充分混合。 注意：20 µL MDR指示剂原液足以装满一块板。 未密封的MDR指示剂原液可以分装，并在<-20℃下保存1个月。 避光，并避免反复冻融。

工作溶液配制

MDR染料加载溶液：将20 µL的MDR指示剂储备溶液添加到10 mL的测定缓冲液（组分C）中，并充分混合。 注意：MDR染料加载溶液足以装满一块板，并且在室温下至少可稳定2小时。

实验步骤

1. 通过将10 µL的10X（96孔板）或5 µL的5X（384孔板）化合物加入化合物缓冲液（如PBS或HHBS）中来处理细胞。对于空白孔（没有细胞的培养基），添加相应量的化合物缓冲液。注意：添加化合物之前不必洗涤细胞。但是，如果测试的化合物对血清敏感，则可以在添加化合物之前将生长培养基和血清因子吸掉。抽吸后，向孔中添加相同体积的HHBS（例如，对于96孔板为90 µL，对于384孔板为20 µL）。或者，细胞可以在无血清培养基中生长。

2. 在室温下或在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育细胞板至少15分钟。

3. 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的MDR染料加载溶液。

4. 在避光条件下，于室温下孵育染料加载板1小时。注意：适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。注意：上样后请勿洗涤细胞。注意：对于非贴壁细胞，建议在孵育后以800 rpm离心细胞板2分钟。

5. 使用底部读取模式检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度。

图示

图1.环孢菌素A对MCF-7 / ADR细胞中P-gp的抑制作用。 环孢菌素A浓度的增加导致荧光信号的增加，这是由于P-gp的抑制所致，从而增强了MDR指示剂染料在细胞内的积累。 EC50 = 2.4μM（用试剂盒测量）。