Screen Quest 发光法钙离子检测试剂盒

简要概述

钙通量测定法是 发现中筛选G蛋白偶联受体（GPCR）的方法。该试剂盒使用高度钙敏感和膜通透的腔肠素类似物作为用载脂蛋白基因转染细胞的钙指示剂。水母发光蛋白是来自维多利亚水母的钙敏感生物发光蛋白，已广泛用作细胞中的钙指示剂。当与钙离子结合时，水母发光蛋白复合物发出蓝光。发光强度与Ca ²⁺浓度成正比。我们的腔肠素试剂盒比荧光钙测定试剂盒（如Fluo-4，Fluo-3，Calcium-3和Calcium-4）灵敏得多。该试剂盒提供了一种优化的测定方法，用于检测G蛋白偶联受体（GPCR）和钙通道。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行，并易于适应自动化。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 发光法钙离子检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 通过去除生长培养基制备细胞

2. 加入腔肠素装载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）

3. 在室温下孵育3-4小时

4. 检测水母发光蛋白的发光强度

溶液配制

储备溶液配制

1.腔肠素类似物：将250 µL 100％ETOH（组分B）加到腔肠素类似物（组分A）的小瓶中，并充分混合。 注意：25 µL重组腔肠素类似物对于一块板就足够了。 如果将试管密封，则未使用的腔肠素类似物原液可在<-20℃下保存一个月以上。 避光并避免重复的冻融循环。

2.分析缓冲液（1X）：a）对于＃36305（10板试剂盒），准备使用1X分析缓冲液（组分C）。b）对于 ＃36306（100板试剂盒），通过将10 mL的10X分析缓冲液（组分C）稀释到90 mL的HHBS缓冲液（试剂盒中未提供）中，制成1X分析缓冲液，并充分混合。 注意：10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 将未使用的1X分析缓冲液存储在4℃下。

工作溶液配制

腔肠素装载溶液：将25 µL ETOH重构的腔肠素类似物（储备溶液制备）添加到10 mL 1X分析缓冲液（储备溶液制备）中，并充分混合。 注意：该工作溶液在室温下至少可稳定2小时，并避免光照。

实验步骤

1.从细胞板中去除生长培养基。 注意：重要的是去除生长培养基，以大程度地减少化合物对血清或培养基的干扰。 注意：将细胞在含0.5-1％FBS的生长培养基中培养，以避免去除培养基的步骤。 在这种情况下，需要在1X缓冲液中装载2X腔肠素。

2.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的腔肠素加载溶液添加到细胞板中。

3.在避光的条件下，于室温下孵育腔肠素装载板3-4小时。

4.用HHBS或所需的缓冲液准备复合板。

5.通过使用具有光电倍增管的封闭腔室的光子检测系统，检测水母发光蛋白的发光强度。 仪器必须完全排除外部光线。

图示

图1. CHO-aeq细胞上的ATP剂量反应。 用载脂蛋白精稳定转染的CHO细胞以50,000个细胞/ 100 µL /孔接种在Costar白色96孔板中过夜。 除去生长培养基，并使用Screen Quest 腔肠素钙测定试剂盒将细胞与100 µL染料上载溶液一起在室温下孵育3小时，并避光。 由NOVOstar（BMG Labtech）添加ATP（25 µL /孔），以达到 终指示的浓度。 ATP的EC50约为0.8 µM。

Screen Quest 膜电位检测试剂盒 橙色荧光

简要概述

膜电位是细胞内外的电压差。膜电位使细胞发挥电池的作用，为各种嵌入膜内的“分子器件”提供动力。在神经元等电兴奋性细胞中，膜电位被用来在细胞的不同部位传递信号。在膜的某一点上打开或关闭离子通道会使膜电位发生局部变化，从而使电流迅速流向膜的其他点。离子通道已被确定为重要的 发现靶点。我们的Screen Quest 膜电位检测试剂盒是一种具有快速读取的均相检测方法。它使用我们专有的长波长膜电位指示剂检测由离子通道的打开和关闭引起的膜电位变化。试剂盒中使用的膜电位指示剂的红色荧光增强了进入细胞的荧光，并将筛选化合物和细胞自身荧光造成的干扰降至 低。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 膜电位检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 在生长培养基中准备细胞

2. 添加MP染料工作液

3. 在室温下孵育30至60分钟

4. 检测添加膜电位后化合物的荧光变化

溶液配制

储备溶液配制

1.分析缓冲液原液（1X）：将1 mL的10X分析缓冲液（组分B）添加到9 mL的HHBS中（组分C，不包括#36001），并充分混合。 注意：10 mL的1X分析缓冲液足以用于1个板。

工作溶液配制

将15 uL的MP Sensor（组分A）添加到10 mL的1X 分析缓冲液储备溶液中并充分混合。 该工作溶液在室温下稳定至少两个小时。

实验步骤

1.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）MP染料工作溶液添加到细胞板中。注意：如果您的筛选化合物干扰了生长培养基和血清因子，那么在添加MP染料工作溶液之前，用等体积的HHBS缓冲液替换生长培养基。或者，细胞可以在无血清条件下生长。注意：上色后请勿清洗细胞。

2.在细胞培养箱中孵育工作溶液板30分钟。注意：在某些情况下，在室温下孵育30至60分钟可能会更好。

3.通过使用HHBS或所需的缓冲液来准备复合板。

4.在加入化合物的前后，使用荧光酶标仪中的内置液体处理器，通过检测Ex / Em = 530/570 nm处的荧光来运行膜电势测定。注意：在实验之前进行信号测试非常重要，不同的仪器具有各自的强度范围。将信号测试强度调整为 仪器强度计数的10％到15％。例如，FLIPR-384的 荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置，使其信号测试强度约为7,000至10,000。

图示

图1.用P2X受体瞬时转染的HEK细胞中的ATP剂量反应。 用P2X受体瞬时转染的HEK细胞以40,000个细胞/ 100 µL /孔的速度在Costar黑墙/透明底部96孔板中过夜接种。 将细胞与100 µL MP染料上载溶液在5％CO2、37°C的培养箱中孵育60分钟。 FlexStation添加了ATP（50 µL /孔）以达到 终指示的浓度。 用底部读取模式在Ex / Em = 530/570 nm（在550 nm处截止）下测量荧光信号。

Screen Quest 比色法葡萄糖摄取检测试剂盒

简要概述

        Screen Quest 比色法葡萄糖摄取检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于葡萄糖检测的试剂盒，葡萄糖转运系统负责将葡萄糖转运穿过细胞膜。测量组织和细胞中2-葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖（2-DG）的摄取被广泛接受作为估计葡萄糖摄取量和研究葡萄糖代谢的调节和胰岛素抗性机制的可靠方法。 2-DG摄取通常通过使用用氚或C14标记的非代谢的2-DG来确定。然而，常规使用放射性标记的探针是昂贵的并且需要繁琐的特殊处理程序。 AAT Bioquest的Screen Quest™比色葡萄糖摄取分析试剂盒可在组织或培养细胞中提供灵敏的非放射性分析。在该测定中，2-DG被葡萄糖转运蛋白吸收，并代谢成（2-DG6P）。不可代谢的2-DG6P在细胞中积累，并且与细胞的葡萄糖摄取成比例。累积的2-DG6P被酶促氧化并产生NADPH，其通过显色NADPH特异性监测。通过读取波长570nm至610nm的OD比，可以通过吸收酶标仪读取信号。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 比色法葡萄糖摄取检测试剂盒。 

产品说明书

样品实验方案

简要概述

平板细胞并根据需要处理细胞
加入10μL/孔2-DG并在37℃下孵育20-40分钟
洗涤细胞并裂解细胞
加入50μl/孔的2-DG Uptake Assay工作溶液
在室温下孵育30至120分钟
监测OD比率增加至570/610 nm

溶液制备

1.储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
KRPH缓冲液原液（1X）：
将20mL KRPH缓冲液（5X）（组分H）加入到80mL去离子水中并充分混合。 注意：对于大约一个96孔板，50 mL体积的1×KRPH缓冲液就足够了。 按比例准备所需的音量。 将未使用的1×KRPH存放在4ºC或-20ºC。

2.工作溶液配制

2.1 NADP工作溶液：
将100μLH2O加入到NADP（组分G）的小瓶中并充分混合。

2.2酶探针工作溶液：
将5mL测定缓冲液（组分F）加入酶探针瓶（组分E）中并充分混合。

2.3 2-DG摄取分析工作溶液：
将100μL的NADP工作溶液加入酶探针工作溶液中并充分混合。 注意：这些数量适用于一个96孔板。

有关细胞样品制备的指南，请点击查看。

操作步骤

重要提示：该方案可用作培养3T3-L1脂肪细胞用于2-DG摄取的指导。

1.在生长培养基中以50,000-80,000细胞/孔/100μL/ 96孔或12,500-20,000细胞/孔/25μL/ 384-孔黑壁/透明底细胞培养Poly-D赖氨酸平板培养4-6小时。

2.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）无血清培养基除去细胞。将细胞在37ºC，5％CO₂培养箱中孵育6小时至过夜。

3.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μL/孔1×KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞两次。

4.加入90μL/孔葡萄糖摄取缓冲液（组分B）并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育细胞1小时。

5.用或不用胰岛素或试验化合物刺激20分钟。加入10μL/孔的10×胰岛素溶液至终浓度为1μM或10×化合物测试溶液。并且还向未处理的孔中加入10μL胰岛素载体缓冲液或复合载体缓冲液作为对照，并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育20分钟。

6.对于葡萄糖摄取抑制研究，加入10×Phloretin至终浓度为200 uM或测试抑制剂，并在37ºC，5％CO₂下孵育2-5分钟。注意：建议将10mL抑制剂载体缓冲液加入胰岛素处理和未处理的孔中作为对照。 Phloretin处理的细胞可用作阳性对照。

7.向每个孔中加入10μL/孔2-DG溶液（组分A），并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育20-40分钟。对于阴性对照，留下一些未经胰岛素，抑制剂和2-DG处理的孔。

8.处理后，取出每孔中的溶液，用KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞3次，100μL/孔，从溶液中除去额外的2-DG。从孔中移除KRPH缓冲液。

9.向每个孔中加入25μL/孔酸性裂解缓冲液（组分C），并在37℃下孵育20分钟以裂解细胞。并且可以同时制备2DG摄取测定混合物。

10向每个孔中加入25μL/孔中和缓冲液（组分D），充分混合，在室温下放置5-10分钟以中和细胞裂解物。

11.向2DG6P标准品或细胞裂解液的每个孔中加入50μL2DGUptake Assay工作溶液。

12.在室温下孵育反应30分钟至2小时，避光。

13.使用吸光度板读数器监测570 / 610nm处的吸光度比增加。

数据分析

氯离子通道具有多种重要的生理和细胞功能，包括pH调节，体积稳态，有机溶质运输，细胞迁移， 。氯离子通道代表有价值的 靶标。许多慢性疾病状态如囊性纤维化和Bartter综合征是由于氯离子通道功能的缺陷。然而，用于筛选氯离子通道调节剂的现有技术是吞吐量，灵敏度和生理相关性之间的折衷。 Screen Quest™比色氯化物通道分析试剂盒为研究氯离子通道提供了灵敏且稳健的比色方法。该测定基于我们专有的碘化物指示剂（Iodide Blue™）测量碘化物浓度，通过该测定检测到低至30nM的碘化物。 Screen Quest™氯离子通道分析试剂盒为监测氯离子通道提供了一种优化的分析方法。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。

Screen Quest 膜电位检测试剂盒 红色荧光

简要概述

Screen Quest 膜电位检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测膜电位的试剂盒，膜电位是电池内部和外部之间的电压差。膜电位允许电池充当电池，提供电力以操作嵌入膜中的各种“分子装置”。在诸如神经元的可电激发细胞中，膜电位用于在细胞的不同部分之间传递信号。在膜中的一个点处打开或关闭离子通道产生膜电位的局部变化，这导致电流快速流到膜中的其他点。离子通道已被确定为重要的 发现目标。我们的Screen Quest 膜电位检测试剂盒是一种均质检测，具有快速读取时间。它使用我们专有的长波膜电位指示器来检测由离子通道的打开和关闭引起的膜电位变化。试剂盒中使用的膜电位指示剂的红色荧光在进入细胞时具有增强的荧光，并 小化由筛选化合物和/或细胞自发荧光引起的干扰。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 膜电位检测试剂盒。 

产品说明书

样品实验方案

简要概述

在生长培养基或HHBS中制备细胞
添加MP染料加载溶液（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）
在室温或37℃孵育1小时
监测Ex / Em = 620 / 650nm处的荧光强度

工作溶液配制

MP染料加载方案：将1mL 10X MP（组分A）加入9mL HHBS（组分B）中，并充分混合。 注意：MP染料加载溶液在室温下稳定至少2小时。 注意：1 mL 10X MP传感器足以容纳一块板。 如果储存得当，未使用的10X MP（A组分）可以等分并在<-20℃下储存几个月。 避免反复冻融循环。 注意：为方便起见，HHBS（组分B）可以存储在4℃。有关细胞样品制备的指南，请点击查看。

操作步骤

1.向细胞板中加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的MP染料加载溶液。注意：如果筛选化合物干扰生长培养基和血清因子，在添加MP染料加载溶液之前，用等体积的HHBS缓冲液替换生长培养基。或者，细胞可以在无血清条件下生长。注意：加载染料后请勿清洗细胞。

2.将染料加载板在5％CO₂,37℃培养箱中孵育30至60分钟。注意：在某些情况下，室温孵育30至60分钟可能会更好。

3.使用HHBS（组分B）或所需的缓冲液制备复合板。用HHBS或所需缓冲液制备化合物板。

4.监测Ex / Em = 620 / 650nm处的荧光强度。注意：在实验前进行信号测试非常重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到 仪器强度计数的10％至15％的水平。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（对照（Max）的％）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算ATP样品。 

Screen Quest 膜电位检测试剂盒 红色荧光

简要概述

Screen Quest 膜电位检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测膜电位的试剂盒，膜电位是电池内部和外部之间的电压差。膜电位允许电池充当电池，提供电力以操作嵌入膜中的各种“分子装置”。在诸如神经元的可电激发细胞中，膜电位用于在细胞的不同部分之间传递信号。在膜中的一个点处打开或关闭离子通道产生膜电位的局部变化，这导致电流快速流到膜中的其他点。离子通道已被确定为重要的 发现目标。我们的Screen Quest 膜电位检测试剂盒是一种均质检测，具有快速读取时间。它使用我们专有的长波膜电位指示器来检测由离子通道的打开和关闭引起的膜电位变化。试剂盒中使用的膜电位指示剂的红色荧光在进入细胞时具有增强的荧光，并 小化由筛选化合物和/或细胞自发荧光引起的干扰。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 膜电位检测试剂盒。 

产品说明书

样品实验方案

简要概述

在生长培养基或HHBS中制备细胞
添加MP染料加载溶液（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）
在室温或37℃孵育1小时
监测Ex / Em = 620 / 650nm处的荧光强度

工作溶液配制

MP染料加载方案：将1mL 10X MP（组分A）加入9mL HHBS（组分B）中，并充分混合。 注意：MP染料加载溶液在室温下稳定至少2小时。 注意：1 mL 10X MP传感器足以容纳一块板。 如果储存得当，未使用的10X MP（A组分）可以等分并在<-20℃下储存几个月。 避免反复冻融循环。 注意：为方便起见，HHBS（组分B）可以存储在4℃。有关细胞样品制备的指南，请点击查看。

操作步骤

1.向细胞板中加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的MP染料加载溶液。注意：如果筛选化合物干扰生长培养基和血清因子，在添加MP染料加载溶液之前，用等体积的HHBS缓冲液替换生长培养基。或者，细胞可以在无血清条件下生长。注意：加载染料后请勿清洗细胞。

2.将染料加载板在5％CO₂,37℃培养箱中孵育30至60分钟。注意：在某些情况下，室温孵育30至60分钟可能会更好。

3.使用HHBS（组分B）或所需的缓冲液制备复合板。用HHBS或所需缓冲液制备化合物板。

4.监测Ex / Em = 620 / 650nm处的荧光强度。注意：在实验前进行信号测试非常重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到 仪器强度计数的10％至15％的水平。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（对照（Max）的％）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算ATP样品。 

Screen Quest 比色法氯离子通道检测试剂盒

简要概述

氯离子通道具有多种重要的生理和细胞功能，包括调节pH值，体内稳态，有机溶质转运，细胞迁移。氯离子通道代表了有价值的药靶标。许多慢性疾病状态，例如囊性纤维化和Bartter综合征，是由于氯化物通道功能的缺陷所致。Screen Quest 比色氯通道测定试剂盒为研究氯离子通道提供了灵敏而稳定的比色方法。该测定法基于我们专有的碘化物指示剂（Iodide Blue ），用于测量碘化物浓度，该测定法检测到的碘化物低至30 nM。 Screen Quest 氯离子通道测定试剂盒提供了一种用于检测氯离子通道的优化测定方法。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行，并易于适应自动化。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 比色法氯离子通道检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 准备细胞

2. 除去生长培养基

3. 加入I-Loading Buffer，用筛选化合物处理细胞

4. 用DPBS缓冲液洗涤细胞3次

5. 用1X裂解液裂解细胞

6. 添加等体积的I-sensor（50或25 µL）

7. 将0.1X加到I- Sensor Enhancer（50或25 µL）

8. 在室温下孵育10秒至10分钟

9. 检测380 nm，405 nm或630 nm处的吸光度

溶液配制

储备溶液配制

细胞裂解缓冲液（1X）：将整个小瓶的10X细胞裂解缓冲液（组分D）添加到45 mL无菌H₂O中，并充分混合。 注意：5 mL 1X细胞裂解缓冲液足以装满一块板。 将未使用的1X细胞裂解缓冲液储存在4℃。

工作溶液配制

I- Sensor Enhancer工作溶液（1X）：将50 µL 100X碘化物增强指示剂（组分B）加入5 mL无菌H₂O中并充分混合。 注意：1X I- Sensor Enhancer工作溶液不稳定，请稀释后2小时内使用。 注意：应单独评估每个细胞系，以确定I-Sensor Enhancer溶液的稀释度。 我们观察到0.1X I-Sensor Enhancer工作溶液在某些细胞系中效果更好。

实验步骤

1.碘化物流出测定

1.1从细胞板上吸出生长培养基。

1.2加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的预热I-上样缓冲液（组分C）并孵育2-4小时。

1.3完全吸出碘化物上样缓冲液。 用DPBS或HBSS清洗细胞至少3次。

1.4在HBSS缓冲液中用激动剂处理细胞5分钟。 注意：为筛选拮抗剂，将化合物与I上样缓冲液孵育至少30分钟，然后再用DPBS或HBSS缓冲液洗涤细胞。

1.5吸出上清液。

1.6通过添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X细胞裂解缓冲液来裂解细胞。

1.7进行碘化物测定。

2.用于碘化物流入分析

2.1从细胞板上吸出生长培养基。

2.2加入预热的I-上样缓冲液（组分C）和测试化合物100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）并孵育5分钟。

2.3完全吸出碘化物上样缓冲液。 用HBSS洗涤细胞3次。

2.4通过添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X细胞裂解缓冲液来裂解细胞。

2.5进行碘化物测定。

3.运行碘化物测定

3.1从碘化物流入/流出测定选择的孔中添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Iodide Blue 指示剂（组分A）。

3.2向混合物中加入50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X碘化物指示剂增强剂溶液。 注意：对于某些细胞系，您可能需要将增强剂溶液稀释至0.1X。

3.3在室温下孵育10秒-10分钟。 注意：应单独评估每个细胞系，以确定孵育时间。 注意：由于存在高浓度的碘化物，蓝色可能在数秒至数分钟内变为黄色。

3.4检测630、380或405 nm处的吸光度。

图示

图1. NaI剂量反应是在透明的96孔板上用Screen Quest 比色氯通道测定试剂盒测量的。

Screen Quest 荧光法葡萄糖摄取检测试剂盒

简要概述

        Screen Quest 荧光法葡萄糖摄取检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于葡萄糖检测的试剂盒，葡萄糖转运系统负责将葡萄糖转运穿过细胞膜。测量组织和细胞中2-葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖（2-DG）的摄取被广泛接受作为估计葡萄糖摄取量和研究葡萄糖代谢的调节和胰岛素抗性机制的可靠方法。 2-DG摄取通常通过使用用氚或C14标记的非代谢的2-DG来确定。然而，常规使用放射性标记的探针是昂贵的并且需要繁琐的特殊处理程序。 AAT Bioquest的Screen Quest 荧光葡萄糖摄取分析试剂盒可在细胞中提供灵敏的非放射性分析。在该测定中，2-DG被葡萄糖转运蛋白吸收，并代谢成（2-DG6P）。不可代谢的2-DG6P在细胞中积累，并且与细胞的葡萄糖摄取成比例。累积的2-DG6P被酶促氧化并产生NADPH，其通过荧光NADPH传感器特异性监测。可以通过荧光酶标仪读取信号。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 荧光法葡萄糖摄取检测试剂盒。 

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.平板细胞并根据需要处理细胞
2.加入10μL/孔2-DG并在37℃下孵育20-40分钟
3.洗涤细胞并裂解细胞
4.加入50μl/孔的2-DG Uptake Assay工作溶液
5.在室温下孵育30至120分钟
6.监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光增加

溶液配制

1.储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
KRPH缓冲液原液（1X）：
将20mL KRPH缓冲液（5X）（组分H）加入到80mL去离子水中并充分混合。 注意：对于大约一个96孔板，50 mL体积的1×KRPH缓冲液就足够了。 按比例准备所需的音量。 将未使用的1×KRPH存放在4ºC或-20ºC。

2.工作溶液配制

1. NADP工作溶液：
将100μLH₂O加入到NADP（组分G）的小瓶中并充分混合。

2.酶探针工作溶液：
将5mL测定缓冲液（组分F）加入酶探针瓶（组分E）中并充分混合。

3. 2-DG摄取分析工作溶液：
将100μL的NADP工作溶液加入酶探针工作溶液中并充分混合。 注意：这些数量适用于一个96孔板。

操作步骤

重要提示：该方案可用作培养3T3-L1脂肪细胞用于2-DG摄取的指导。

1.在生长培养基中以50,000-80,000细胞/孔/100μL/ 96孔或12,500-20,000细胞/孔/25μL/ 384-孔黑壁/透明底细胞培养Poly-D赖氨酸平板培养4-6小时。

2.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）无血清培养基除去细胞。将细胞在37ºC，5％CO₂培养箱中孵育6小时至过夜。

3.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μL/孔1×KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞两次。

4.加入90μL/孔葡萄糖摄取缓冲液（组分B）并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育细胞1小时。

5.用或不用胰岛素或试验化合物刺激20分钟。加入10μL/孔的10×胰岛素溶液至终浓度为1μM或10×化合物测试溶液。并且还向未处理的孔中加入10μL胰岛素载体缓冲液或复合载体缓冲液作为对照，并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育20分钟。

6.对于葡萄糖摄取抑制研究，加入10×Phloretin至终浓度为200 uM或测试抑制剂，并在37ºC，5％CO₂下孵育2-5分钟。注意：建议将10mL抑制剂载体缓冲液加入胰岛素处理和未处理的孔中作为对照。 Phloretin处理的细胞可用作阳性对照。

7.向每个孔中加入10μL/孔2-DG溶液（组分A），并在37℃，5％CO₂培养箱中孵育20-40分钟。对于阴性对照，留下一些未经胰岛素，抑制剂和2-DG处理的孔。

8.处理后，取出每孔中的溶液，用KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞3次，100μL/孔，从溶液中除去额外的2-DG。从孔中移除KRPH缓冲液。

9.向每个孔中加入25μL/孔酸性裂解缓冲液（组分C），并在37℃下孵育20分钟以裂解细胞。并且可以同时制备2DG摄取测定混合物。

10.向每个孔中加入25μL/孔中和缓冲液（组分D），充分混合，在室温下放置5-10分钟以中和细胞裂解物。

11.向2DG6P标准品或细胞裂解液的每个孔中加入50μL2DGUptake Assay工作溶液。

12.在室温下孵育反应30分钟至2小时，避光。

13.用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的荧光板读数器监测荧光增加（Ex / Em = 540 / 590nm，在570nm处截止）。

数据分析

Screen Quest 荧光法多 抗性MDR检测试剂盒 *1板*

简要概述

肿瘤细胞对细胞 的耐药性被认为是化疗成功的主要障碍之一。有些肿瘤 初是耐药的，对细胞抑制 治疗没有反应；另一些肿瘤 初反应良好，但 终会再生并产生耐药性。这种现象可能是由所给抗肿瘤 诱导的基因突变引起的，也可能代表恶性肿瘤中已存在的耐药细胞群的选择。多药耐药（MDR）是多种化疗失败的主要因素。在过去的几年中，人们普遍认为化疗耐药性与至少两个ATP依赖的 外排的过度表达有关。这些细胞膜蛋白，称为P-糖蛋白（Pgp，MDR1）和多药耐药相关蛋白（MRP1）是ABC转运体家族的成员。我们的检测试剂盒使用荧光MDR指示剂来检测这两种MDR活性。这种疏水性荧光染料分子迅速穿透细胞膜并保留在细胞内。短时间培养后，细胞内游离染料浓度明显增加。在表达MDR1和/或MRP1的细胞中，该染料被MDR转运体挤压，从而降低细胞荧光强度。然而，当其挤压被干扰MDR1和MRP1活性的试剂阻断时，其细胞荧光强度明显增加。我们的MDR检测试剂盒提供了一个优化的检测方法的所有必须成分。该方法可在96孔或384孔微孔板中进行，且易于自动化。该试剂盒是高通量筛选MDR抑制剂或鉴定具有高水平MDR活性细胞的理想试剂盒。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 荧光法多 抗性MDR检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 准备细胞

2. 添加MDR抑制剂或化合物

3. 添加MDR染料加载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）

4. 在室温下孵育1小时

5. 使用底部读取模式检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

溶液配制

储备溶液配制

MDR指示剂储备溶液：将20 µL（#36340-1板）或200 µL（#36341-10板）添加到MDR指示剂（组分A）中，并充分混合。 注意：20 µL MDR指示剂原液足以装满一块板。 未密封的MDR指示剂原液可以分装，并在<-20℃下保存1个月。 避光，并避免反复冻融。

工作溶液配制

MDR染料加载溶液：将20 µL的MDR指示剂储备溶液添加到10 mL的测定缓冲液（组分C）中，并充分混合。 注意：MDR染料加载溶液足以装满一块板，并且在室温下至少可稳定2小时。

实验步骤

1. 通过将10 µL的10X（96孔板）或5 µL的5X（384孔板）化合物加入化合物缓冲液（如PBS或HHBS）中来处理细胞。对于空白孔（没有细胞的培养基），添加相应量的化合物缓冲液。注意：添加化合物之前不必洗涤细胞。但是，如果测试的化合物对血清敏感，则可以在添加化合物之前将生长培养基和血清因子吸掉。抽吸后，向孔中添加相同体积的HHBS（例如，对于96孔板为90 µL，对于384孔板为20 µL）。或者，细胞可以在无血清培养基中生长。

2. 在室温下或在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育细胞板至少15分钟。

3. 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的MDR染料加载溶液。

4. 在避光条件下，于室温下孵育染料加载板1小时。注意：适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。注意：上样后请勿洗涤细胞。注意：对于非贴壁细胞，建议在孵育后以800 rpm离心细胞板2分钟。

5. 使用底部读取模式检测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度。

图示

图1.环孢菌素A对MCF-7 / ADR细胞中P-gp的抑制作用。 环孢菌素A浓度的增加导致荧光信号的增加，这是由于P-gp的抑制所致，从而增强了MDR指示剂染料在细胞内的积累。 EC50 = 2.4μM（用试剂盒测量）。