PANAGENE FISH（荧光原位杂交）PNA 端粒探针方案

PANAGENE F1001

原则上，荧光原位杂交 (FISH) 应该能够提供单个染色体端粒长度的信息。直接标记的寡核苷酸探针由于其体积小（良好的穿透特性）、单链性质（探针无变性）和受控的合成，是此类分析的有吸引力的探针。然而，端粒重复序列的寡核苷酸杂交的效率还不足以将这种方法扩展到各种物种染色体中 TTAGGG 重复序列的定性研究之外。近研究表明，肽核酸 (PNA) 寡核苷酸探针将与互补的寡核苷酸序列杂交，产生的双链比 DNA/DNA 或 DNA/RNA 双链更稳定。在 PNA 中，传统 DNA 和 RNA 寡核苷酸的带电磷酸-（脱氧）核糖骨架被通过肽键连接的重复 N-（2-氨基乙基）-甘氨酸单元的不带电骨架取代。与 DNA 寡核苷酸相比，PNA 寡聚体表现出更高的序列特异性、改善的稳定性、重现性和更低的背景。由于 PNA/DNA 双链的 Tm 较高，短（18 聚体）端粒 PNA (CCCTAA)3 应用广泛。

开始前要做的事情二、杂交

1. 将载玻片置于 80 °C 预热培养箱中 5 min。

I. 端粒 PNA 探针的制备

1. 打开试管前离心试管，以便在试管底部收集冻干 PNA 探针。

2. 向管中加入甲酰胺，得到 PNA 探针的储备液。

3. 在 PNA 杂交缓冲液中将贮备液稀释至终浓度 200 nM。

ü 注：将 PNA 探针溶液在 4 ℃ 下避光储存。

II. 溶液制备

1. 杂交缓冲液

20 mM 钠2HPO4, pH 7.4

20 mM Tris，pH 7.4

60% 甲酰胺 2X SSC

0.1µg/ml 鲑鱼精子 DNA

2. RNase A 溶液

100µg/ml RNase A（2X SSC 中）

3. 胃蛋白酶 0.005% 溶液

50µl 5% 胃蛋白酶贮备液溶于 50 mL 0.01 MHCl 中。

ü 注：新鲜！使用前加热至 45 ℃。

4. 洗涤液

2X SSC/0.1% 吐温-20

杂交和洗涤

I. 预处理

1. 按照特定细胞系推荐的程序制备载玻片，并风干。

2. 将载玻片在 PBS 中浸泡 15 min。

3. 将载玻片在 4% 甲醛的 PBS 中 37 °C 固定 4 min。

4. 37 °C PBS 洗 5 min (X2)。

5. 向一个干净的平板中加入 500µl RNase A 溶液，并将每个载玻片面朝下置于 RNase A 溶液上，在 37 ℃ 下孵育 1 h。

ü 注：注意不要干燥。

6. 在 2X SSC（X3 重复）中清洗，并在 DW 中清洗。

7. 在 37 °C 下，将载玻片在 0.005% 胃蛋白酶中浸泡 4 min。

8. 37 °C PBS 洗 3 min (X2)。

9. 重复步骤 3-4。

10. 室温下在 PBS 中清洗 5 min。

11. 在冷乙醇系列中脱水载玻片（在 70%、85%、100% 中脱水 1 min）。

12. 晾干载玻片。

2. 向每张载玻片的标记区域加入 20µl PNA 探针的杂交缓冲液。

ü 注：使用前 90 °C 加热杂交缓冲液 5 min。

3. 用 18 x 18 mm 盖玻片覆盖载玻片上的标记区域。

ü 注：注意不要干燥。

4. 将载玻片在 85 °C 下变性 10 min。

ü 注：变性应在低 80 ℃ 和高 90 ℃ 之间进行。

仔细检查培养箱的温度。75 °C 以下的变性温度严重损害结果。

5. 将载玻片在室温下避光放置 1 h。

III. 洗涤

1. 在室温下将载玻片浸入洗涤液中，以取出盖玻片。

2. 在 55‐60 °C 下用清洗液清洗载玻片 10 min (X2)。

ü 注：应在 55-60 ℃ 下进行清洗。

3. 将载玻片在清洗液中清洗 1 min

室温。

IV. 复染

1. 将载玻片在 DAPI/2X SSC 中染色 10 min。

2. 在 2X SSC 中清洗载玻片 2 min。

3. 在 1X SSC 中清洗载玻片 2 min。

4. 在 DW 中清洗载玻片 2 min。

5. 用离心机干燥载玻片。

6. 在载玻片的目标区域滴一滴封片剂。

7. 盖上盖玻片，使溶液均匀分布在盖玻片下。避免产生气泡。

8. 使用带有适当滤光片的荧光显微镜观察染色载玻片。

V. 参考文献

1. Kentaro Taemura等人2005,Developmental Biology 281,196‐207.

2. Won‐Woo Lee等人2002,Immunology 105,458‐465.

3. Heather Perry.等人。2001,Journal of Microbiological Methods 47,281‐292.

4. 陈彩福等人。1999，哺乳动物基因组 10，13‐18。

5. M. Hultdin等人。1998,Nucleic Acids Research 26 (16) ,3651‐3656.

6. Peter M. Landsdorp等人。1996,Human Molecular Genetics 5 (5) ,685‐691.