Amplite NADPH检测试剂盒(比色法)
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货号 |
15272 |
存储条件 |
在零下15度以下保存, 避免光照 |
| 规格 |
400 Tests |
价格 |
3264 |
| Ex (nm) |
460 |
Em (nm) |
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| 分子量 |
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溶剂 |
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| 产品详细介绍 |
简要概述
Amplite NADPH检测试剂盒(比色法)是美国AAT Bioquest研发的检测NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADPH检测试剂盒为检测NADPH提供了一种便捷的方法。 NADPH探针是一种生色传感器，在NADPH减少时具有460nm的最大吸光度。 NADPH探针的吸收与溶液中NADPH的浓度成正比。 Amplite 比色NADPH检测试剂盒提供灵敏的检测方法，可在100μL检测体积中检测低至3μM的NADPH。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的NADH检测试剂盒。
适用仪器
| 光吸收酶标仪 |
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| 吸收： |
460nm |
| 推荐孔板： |
透明底板 |
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备NADPH反应混合物（50μL）
加入NADPH标准品或测试样品（50μL）
在室温孵育或15分钟至2小时
孵育460 nm处的监测吸光度
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADPH原液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。
注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.准备NADPH反应混合物：
将1mL NADPH探针（组分A）加入4mL NADPH测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：5mL NADPH反应混合物用于一个96孔。 未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至100μM）：
3.1将100μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入400μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生200μM（100pmol / L）NADPH标准溶液。
注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL的200μMNADPH标准溶液进行1：2连续稀释，得到NADPH标准品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM连续稀释液。
如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。
注意：根据需要制备细胞或组织样品。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。
表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局
| BL |
BL |
TS |
TS |
| NS1 |
NS1 |
… |
… |
| NS2 |
NS2 |
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| NS3 |
NS3 |
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| NS4 |
NS4 |
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| NS5 |
NS5 |
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| NS6 |
NS6 |
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| NS7 |
NS7 |
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注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品
表2每个孔的试剂组成
| NADPH |
空白对照 |
测试样 |
| 连续稀释：50 ul |
PBS:50 ul |
50 ul |
*注意：将连续稀释的NADPH标准品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份
4.在上清液反应中运行NADPH测定：
4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔
注1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。
注2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去.NADPH标准曲线如图1所示。
图1使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite 比色NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 孵育30分钟（n = 3）可以检测到低至3μM的NAPDH，在460nm处测量吸光度。
附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂
1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。
2.细菌细胞样品：离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，并用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。
4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。
参考文献
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说明书
Amplite NADPH检测试剂盒(比色法).pdf
