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- 产品货号:
- BN16036
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- 中文名称:
- NADP/NADPH检测试剂盒(WST-8法)
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- 品牌:
- Biorigin
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货号
产品规格
售价
备注
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BN16036-100T
100T
¥1500.00
-20℃
产品描述
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BN16036-100T
100T
¥1500.00
-20℃
产品描述
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售价
备注
JP-0760A-1g
1g
¥1650.00
JP-0760A-100mg
100mg
¥240.00
JP-0760A-500mg
500mg
¥990.00
JP-0760A-250mg
250mg
¥540.00
产品描述
上海金畔生物科技有限公司提供NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)检测试剂盒,索莱宝,BC1050-50管/48样,可以访问官网了解更多产品信息。
NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)检测试剂盒,索莱宝,BC1050-50管/48样
浓度 | |
规格 | 50管/48样 |
保存 |
上海金畔生物科技有限公司提供辅酶ⅡNADP(H)含量检测试剂盒,索莱宝,BC1100-50管/24样,可以访问官网了解更多产品信息。
辅酶ⅡNADP(H)含量检测试剂盒,索莱宝,BC1100-50管/24样
浓度 | |
规格 | 50管/24样 |
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上海金畔生物科技有限公司提供NADP磷酸酶(NADPase)检测试剂盒,索莱宝,BC1110-50管/48样,可以访问官网了解更多产品信息。
NADP磷酸酶(NADPase)检测试剂盒,索莱宝,BC1110-50管/48样
浓度 | |
规格 | 50管/48样 |
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上海金畔生物科技有限公司提供NADP苹果酸酶(NADP-ME)检测试剂盒,索莱宝,BC1120-50管/48样,可以访问官网了解更多产品信息。
NADP苹果酸酶(NADP-ME)检测试剂盒,索莱宝,BC1120-50管/48样
浓度 | |
规格 | 50管/48样 |
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上海金畔生物科技有限公司提供NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)检测试剂盒 微量法,索莱宝,BC1055-100管/96样,可以访问官网了解更多产品信息。
NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)检测试剂盒 微量法,索莱宝,BC1055-100管/96样
· 英文名称 : Micro NADP-Malate Dehydrogenase(NAD-MDH)Assay Kit
· 别名 : NADP-苹果酸脱氢酶试剂盒 NADP-MDH Kit NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)试剂盒 NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒
· 检测方法 : 微量法
测定原理:
NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。
需要的仪器,耗材:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
测定意义:
MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸–天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH, NADP-MDH主要存在于真核细胞中。测定原理:NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。需要的仪器,耗材:紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
浓度 | |
规格 | 100管/96样 |
保存 |
上海金畔生物科技有限公司提供辅酶ⅡNADP(H)检测试剂盒 微量法,索莱宝,BC1105-100管/48样,可以访问官网了解更多产品信息。
辅酶ⅡNADP(H)检测试剂盒 微量法,索莱宝,BC1105-100管/48样
· 别名 : 辅酶ⅡNADP(H)含量测定试剂盒 辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒,辅酶ⅡNADP
· 检测方法 : 微量法
测定意义:辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP(NADPH + NADP+)含量和NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
测定原理:分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm下检测吸光值,从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH,从而检测NADP+含量。
需要的仪器,耗材:可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
浓度 | |
规格 | 100管/48样 |
保存 |
上海金畔生物科技有限公司提供NADP磷酸酶(NADPase)检测试剂盒 微量法,索莱宝,BC1115- 100管/96样,可以访问官网了解更多产品信息。
NADP磷酸酶(NADPase)检测试剂盒 微量法,索莱宝,BC1115- 100管/96样
· 英文名称 : Micro NADP Phosphatase (NADPase) Assay Kit
· 别名 : NADP磷酸酶试剂盒 NADPase Kit NADP磷酸酶(NADPase)试剂盒 NADP磷酸酶(NADPase)测试盒
· 检测方法 : 微量法
测定意义:NADPase主要存在于植物组织中,是生物体内唯一催化NADP+降解为NAD+的酶,与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
测定原理:NADPase能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应,通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。
需要的仪器,耗材:可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
浓度 | |
规格 | 100管/96样 |
保存 |
上海金畔生物科技有限公司提供NADP苹果酸酶(NADP-ME)检测试剂盒 微量法,索莱宝,BC1125- 100管/96样,可以访问官网了解更多产品信息。
NADP苹果酸酶(NADP-ME)检测试剂盒 微量法,索莱宝,BC1125- 100管/96样
· 英文名称 : Micro NADP Malic Enzyme(NADP-ME) Assay Kit
· 别名 : NADP苹果酸酶试剂盒 NADP-ME Kit NADP苹果酸酶(NADP-ME)试剂盒 NADP苹果酸酶(NADP-ME)测试盒
· 检测方法 : 微量法
测定意义:ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理:NADP-ME催化NADP+还原成NADPH,在340nm下测定NADPH增加速率。
需要的仪器,耗材:紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
浓度 | |
规格 | 100管/96样 |
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上海金畔生物科技有限公司提供氧化型辅酶Ⅱ钠盐 NADP Na2,索莱宝,N8130-1g CAS : 24292-60-2,可以访问官网了解更多产品信息。
氧化型辅酶Ⅱ钠盐 NADP Na2,索莱宝,N8130-1g CAS : 24292-60-2
· 别名 : 辅酶Ⅱ钠盐;Coenzyme Ⅱ sodium salt;
· 英文名称 : NADP Na2;Triphosphopyridine nucleotide disodium salt
· CAS : 24292-60-2
· 分子式 : 787.4
· 分子量 : C21H26N7Na2O17P3
· 储存条件 : -20℃
· 纯度 : >98%
· 外观(性状) : 白色或浅黄色结晶粉末
· 单位 : 支
说明:生化研究;组织培养基的配制;电位测定。
别名:BETA-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐(NADP);Β–烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐;氧化型辅酶;BETA-烟碱腺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐;氧化型辅酶/NADP;beta-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐;氧化型辅酶II 二钠
浓度 | |
规格 | 1g |
保存 | -20℃ |
上海金畔生物科技有限公司提供氧化型辅酶Ⅱ钠盐 NADP Na2,索莱宝,N8130-100mg CAS : 24292-60-2,可以访问官网了解更多产品信息。
氧化型辅酶Ⅱ钠盐 NADP Na2,索莱宝,N8130-100mg CAS : 24292-60-2
· 别名 : 辅酶Ⅱ钠盐;Coenzyme Ⅱ sodium salt;
· 英文名称 : NADP Na2;Triphosphopyridine nucleotide disodium salt
· CAS : 24292-60-2
· 分子式 : 787.4
· 分子量 : C21H26N7Na2O17P3
· 储存条件 : -20℃
· 纯度 : >98%
· 外观(性状) : 白色或浅黄色结晶粉末
· 单位 : 支
说明:生化研究;组织培养基的配制;电位测定。
别名:BETA-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐(NADP);Β–烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐;氧化型辅酶;BETA-烟碱腺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐;氧化型辅酶/NADP;beta-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐;氧化型辅酶II 二钠
浓度 | |
规格 | 100mg |
保存 | -20℃ |
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
简要概述
Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒 (比色法)是美国AAT Bioquest研发的检测NADP/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和NADP是细胞中发现的两种重要的辅酶。 NADH(NADPH)是NAD(NADP)的还原形式,NAD(NADP)是NADH(NADPH)的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用,在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH(NADP / NADPH)比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分,并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中,游离NAD和NADH之间的比率的估计可以高达700。相反,NADP / NADPH比率通常为约0.005,因此NADPH是该辅酶的主要形式。
该Amplite 比色NADP / NADPH比率分析试剂盒提供了一种比色法,用于测量培养细胞中细胞内总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。 在该测定中,裂解物中的NADPH可以用NADPH提取溶液提取,然后通过NADPH探针识别,在反应后得到黄色染料,其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NADP或NADPH的浓度成正比,可用作细胞NADP / NADPH浓度的指示剂。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的NADP/NADPH检测试剂盒。
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备25μLNADPH标准品和/或测试样品
加入25μLNADPH提取液
在室温下孵育15分钟
加入25μL中和溶液
加入75μLNADPP/ NADPH反应混合物在室温下孵育15分钟至2小时监测 在460nm处的吸光度
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADPH原液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。
注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物:
2.1将8mL NADPH探针缓冲液(组分B-II)加入到NADP / NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
2.2将2 mL NADPH探针(组分B-I)加入上述瓶中(来自步骤2.1)并充分混合。
注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备连续稀释的NADPH标准品(0至2μM):
3.1将2L 1mM NADPH储备溶液(来自步骤1)加入998L PBS缓冲液(pH7.4)中,产生2M(2 pmols / L)NADPH标准溶液。
注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
3.2取200μL2MNADPH标准溶液(来自步骤3.1)进行1:2连续稀释,得到1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。
4.运行总NADP / NADPH分析(总共400个分析/试剂盒):
4.1如说明书中的表1和2中所述,将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。 (详见附录)。
4.2将50μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤4.1)的每个孔中,以使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔。
4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
5.运行NADP / NADPH比率分析(总共250个分析/试剂盒):
5.1如说明书中的表3和4中所述,将连续稀释的NADPH标准品和/或含NADP / NADPH的测试样品加入白色/透明96孔微量培养板中。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。
5.2对于NADPH提取(NADPH量):将25μLNADPH提取溶液(组分D)加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后加入25μL中和溶液(组分E)以中和NADPH提取物,如说明书中的表3和4中所述。
对于总NADP和NADPH(总量):将25μLNADPP/ NADPH对照溶液(组分F)加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟,然后如说明书中的表3和4中所述添加25μL提取对照溶液(组分F)。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞(详见附录)。
5.3将75μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品(NADP / NADPH)的每个孔中,并测试样品(NADPH提取物)(来自步骤5.1)以使总量达到测定体积为150μL/孔。
5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度(仅PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。
图1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪(Molecular devices)测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。
A-总NADPH和NADP剂量反应:孵育1小时可检测到低至0.03μM的总NADPH。
B-NADP / NADPH比例:用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。
附录:使用组分G(NAD / NADH裂解缓冲液)的测试样品制剂
1.植物细胞样品:
用裂解缓冲液以200mg / mL均化,并以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测试。
2.细菌样品:
离心收集细菌细胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液,将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟, 用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样本:
从平板孔中取出培养基,每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液(或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔),并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,使用上清液进行测试。
4.组织样品:
称取约20mg组织,用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测定。
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
货号 | 15264 | 存储条件 | f/l |
规格 | 250 Tests | ||
Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 585 |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(荧光法)红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADP/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和NADP +是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 。 在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。
传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 这些方法具有低灵敏度和高干扰,因为测定是在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行的。 基于吸收的NADP / NADPH测定的低灵敏度使得测定难以自动化以进行通常使用小样品量的高通量筛选。
这种Amplite 荧光NADP / NADPH比率检测试剂盒为敏感检测NADP,NADPH及其比例提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶再循环反应中的NADP / NADPH,其显着提高了检测灵敏度。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显着降低了样品干扰。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可以通过荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm(Ex / Em = 540 / 590nm)或吸光度酶标仪在~576nm处容易地读取。 这也提供NADP,NADPH提取缓冲液和细胞裂解缓冲液。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的NADP/NADPH检测试剂盒。
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备NADPH标准品或测试样品(25μL)
在室温下加入25μLNADPH或NADP提取液孵育15分钟
加入25μLNADP或NADPH提取液(25μL)
加入NADP / NADPH反应混合物(75μL)孵育于 室温保持15分钟 – 2小时
监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADPH原液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。
注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物:
将10mL NADPH传感器缓冲液(组分B)加入NADP / NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至10μM):
3.1将10μL1mMNADPH储备溶液(来自步骤1)加入990μLPBS缓冲液(pH7.4)中,得到10μM(10pmol / L)NADPH标准溶液。
注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
3.2取200μL10M NADPH标准溶液(来自步骤3.1)进行1:3连续稀释,得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0 M系列稀释液。
3.3如表1和2中所述,将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见,NADP / NADPH裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。
表1.实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
TS (NADPH) |
TS (NADHP) |
TS (NADP) |
TS (NADP) |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
…. |
…. |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
||||||
NS3 |
NS3 |
||||||
NS4 |
NS4 |
||||||
NS5 |
NS5 |
||||||
NS6 |
NS6 |
||||||
NS7 |
NS7 |
注意:NS = NADP / NADPH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS(NADPH)=用NADPH提取液处理10至15分钟的测试样品,然后用NADP提取溶液中和; TS(NADP)=用NADP提取溶液处理10至15分钟的测试样品,然后用NADPH提取溶液中和。
表2每个孔的试剂组成
NADPH Standard |
Blank Control |
Test Sample (NADP/NADPH) |
Test Sample (NADPH Extract) |
Test Sample (NADP Extract) |
Serial Dilutions*: 25 μL |
PBS: 25 μL |
Test Sample: 25 μL |
Test Sample: 25 μL |
Test Sample: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component D: 25 μL |
Component E: 25 μL |
Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes |
||||
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component E: 25 μL |
Component D: 25 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
*注意:将连续稀释的NADPH标准品(0.01μM至3μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>100μM,)可能由于NADPH传感器(对非荧光产物)的过度氧化而导致荧光信号降低。
3.4对于NADPH提取(NADPH):将25μLNADPH提取溶液(组分D)加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后加入25μL的NADP提取溶液(组分E)以中和NADPH提取物,如表1和2中所述。
对于NADP提取(NADP):将25μLNAP提取溶液(组分E)加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后加入25μLNADPH提取溶液(组分D)以中和NADP提取物,如表1和2中所述。
对于总NAPD和NADPH:将25μLNADP/ NADPH对照溶液(组分F)加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟,然后如表1和2中所述添加25μL对照溶液(组分F)。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。 NADP / NADPH裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。
4.在上清液反应中运行NADP / NADPH测定:
4.1将75μLNADPH反应混合物(来自步骤2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤3.4)的每个孔中,以使总NADPH测定体积为150μL/孔。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。
注意:也可以将板的内容物转移到白色透明底板上,并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。
数据分析
空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 典型数据如图1所示(总NADP和NADPH对比NADP或NADPH提取物)。
图1.使用Gemini酶标仪(Molecular Devices),在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADP / NADPH比率测定试剂盒测量总NADPH和NADP及其提取物剂量响应。 用或不用NADPH或NADP提取溶液处理25μL等量的NADP和NADPH 15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。 在加入75μLNADPH反应混合物后30分钟,在Ex / Em = 540 / 590nm(在570nm处截止)获得信号。 从具有NADPH反应的那些孔的值中减去空白信号(注意:荧光背景随时间增加,因此重要的是减去每个数据点的空白孔的荧光强度值)。
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(比色法)
货号 | 15274 | 存储条件 | F/L |
规格 | 250 Tests | ||
Ex (nm) | 460 | Em (nm) | |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒 (比色法)是美国AAT Bioquest研发的检测NADP/NADPH的试剂盒,。 NADH(NADPH)是NAD(NADP)的还原形式,NAD(NADP)是NADH(NADPH)的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用,在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH(NADP / NADPH)比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分,并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中,游离NAD和NADH之间的比率的估计可以高达700。相反,NADP / NADPH比率通常为约0.005,因此NADPH是该辅酶的主要形式。
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
货号 | 15266 | 存储条件 | f/l |
规格 | 200 Tests | ||
Ex (nm) | Em (nm) | ||
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
ReadiUse 即用型NADP再生回收试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测NADPH的试剂盒,NADP是用于生物合成反应和脱氢反应的电子受体。 NADP用于合成代谢途径,例如,胆固醇合成和脂肪酸链延伸。它也是许多异生素代谢反应中必需的辅助因子。在叶绿体中,在光合作用反应的电子链的 后一步中,NADP被铁氧还蛋白-NADP还原酶还原为NADPH。许多氧化还原酶和所有连接酶使用NADP / NADPH作为辅酶。 NADP还可用于测定淀粉酶,肌酸激酶,,异柠檬酸脱氢酶。 AAT Bioquest的ReadiUse NADP再生试剂盒提供灵活的预包装NADP再生系统,以适应各种实验设计。它使用两种即用型解决方案,通过简单的混合再生NADP。该试剂盒可用于所有需要NADP的系统(例如:12-酮去氧胆酸合成,铁氧还蛋白还原酶系统)。使用该试剂盒可以进行300-500次酶测定。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的ReadiUse 即用型NADP再生回收试剂盒。
产品说明书
样品实验方案
溶液配制
1.储存溶液配制
所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样,并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 NADPH解决方案(40X):
将0.5 mL H2O加入一小瓶NADPH(组分D)中,制成40X NADPH溶液。 注意:一小瓶NADPH用于制备10 mL NADP再生溶液。
1.2 NADP再生酶混合物溶液(400X):
将100 µL H2O加入小瓶NADP再生酶混合物(组分C)中,制成400X NADP再生酶混合物溶液。 避光。
2.工作溶液配制
加入5 mL的NADP再生缓冲液I(组分A),5 mL的NADP再生缓冲液II(组分B),0.5 mL的40X NADPH溶液和50μL的400X NADP再生酶混合物溶液使总体积为10.55 mL 2X NADP再生溶液。 远离光线。 注意:活化的NADP再生溶液不稳定,应在使用前新鲜配制。 10 mL的NADP再生溶液足以用于1个板。
样品操作及实验分析
将等体积的2X NADP再生溶液添加到所需的测定系统中。
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货号 | 15281 | 存储条件 | f/l |
规格 | 200 Tests | ||
Ex (nm) | 422 | Em (nm) | 466 |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Amplite NADP检测试剂盒 (荧光法)蓝色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADP的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和NADP +是活细胞中发现的许多酶反应的两个重要辅助因子。 。 NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。量化这些因子的产生或消耗是监测酶介导的反应或筛选这些酶反应的调节剂或底物的重要方法。市场上有几种用于量化NADPH或总NADP / NADPH量的试剂盒,但迄今为止在大量过量NADPH存在下检测NADP是非常具有挑战性的,因为NADP在260 nm处具有其吸收峰且不发荧光,使测量不实用。
Amplite 荧光NADP分析试剂盒可快速,快速地检测NADP。该试剂盒使用我们新开发的NADP传感器Quest Fluor NADP试剂直接测量NADP。该试剂盒中使用的专有探针仅与NADP反应产生在Ex / Em = 420 / 480nm处荧光的产物,并且对NADPH几乎没有响应。该试剂盒可在100μL测定体积中检测少至30 nM NADP,并在过量NADPH存在下监测0.3%NADP产生。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且可以用于高通量筛选。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的NADP检测试剂盒。
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备NADP标准品或测试样品(50μL)
添加20μLQuestFluor™NADP探针
添加20μL测定溶液
在室温下孵育10-20分钟
添加15μL增强剂溶液
在室温下孵育10-20分钟,监测420/480 nm的荧光
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分。
操作步骤
1.准备NADP储备溶液:
将500μlddH2O加入到NADP标准品(组分D)的小瓶中以制备1mM NADP储备溶液。
注意:未使用的NADP储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。
2.准备NADP标准品的连续稀释液(0至10μM):
2.1将10μL的NADP储备液(来自步骤1)加入到990L H2O或PBS缓冲液中以产生10M NADP标准溶液。
注意:稀释的NADP标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
2.2取200μL10μMNADP标准溶液,在H2O或PBS中进行1:3连续稀释,得到NADP标准品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM系列稀释液。
2.3如表1所述,将50μL系列稀释的NADP标准品和含有NADP的测试样品加入黑色/固体底96孔微孔板中:
表1黑色/固体底部96孔微孔板中NADP标准品和测试样品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
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NS3 |
NS3 |
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NS4 |
NS4 |
||
NS5 |
NS5 |
||
NS6 |
NS6 |
||
NS7 |
NS7 |
注意1:NS = NADP标准,BL =空白对照,TS =测试样品。
注意2:将连续稀释的NADP标准品(10μM至0.01μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。
3.运行NADP测定:
3.1将20μLQuestFluor NADP探针(组分A)溶液加入NADP标准品,空白对照品和测试样品的每个孔中,充分混合。
3.2将20μL测定溶液(组分B)加入每个孔中,充分混合。
注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和10μLQuestFluor™NADP探针和10μL分析溶液。
3.3在室温下孵育反应10-20分钟,避光。
3.4向每个孔中加入15μL增强剂(组分C),使总NADP测定体积为105μL/孔,并在室温下孵育10-20分钟,避光。
注意:对于384孔板,添加7.5 uL增强剂。
3.5使用荧光板读数器在420/480 nm处检测荧光增加。
数据分析
空白孔中的荧光(仅用H 2 O或PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADP反应的那些孔的值中减去。 NADP标准曲线如图1所示
图1 使用Germini酶标仪(Molecular devices),在96孔黑色/固体底板中用Amplite 荧光NADP测定试剂盒测量NADP剂量反应。 A:NADP标准曲线,在孵育20分钟时可检测到低至30nM的NADP(n = 3)。 B:NADP和NADPH响应的比较C:在溶液中存在100μMNADPH的NADP标准曲线。 从孵育20分钟(n = 3)可以检测到从NADPH转化的低至0.3%的NADP(~300nM)。
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货号 | 15260 | 存储条件 | f/l |
规格 | 400 Tests | 价格 | |
Ex (nm) | 575 | Em (nm) | |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和NADP +是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。。在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。该方法具有低灵敏度和高干扰,因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。
Amplite™比色总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH,其显着提高了检测灵敏度。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在较长波长范围内运行,这显著降低了来自生物样品的干扰。 该实验证明了高灵敏度和低干扰。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。
Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析,可在100μL分析体积(100 nM)内检测少至10皮摩尔的NADP(H)。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且容易适应自动化而无需分离步骤。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取,以提高测定灵敏度。 如果需要更高的灵敏度,建议使用Cat#15259或15264。
产品说明书
96孔板测定示例
概述
准备NADP / NADPH反应混合物(50μL)
加入NADPH标准品或测试样品(50μL)
在室温下孵育15分钟–2小时
监测575±5nm处的吸光度强度
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作方法
1.准备NADPH原液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。
注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物:
将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液(组分B)加入NADP / NADPH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至10μM):
3.1将10μLNADPH储备溶液(来自步骤1)加入990L PBS缓冲液中以产生10M(10pmol / L)NADPH标准溶液。
注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1:3连续稀释,得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。
3.3如表1和表2所述,将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中
注意:根据需要准备细胞或组织样本。
表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
||
NS3 |
NS3 |
||
NS4 |
NS4 |
||
NS5 |
NS5 |
||
NS6 |
NS6 |
||
NS7 |
NS7 |
注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。
表2.每个孔的试剂组成
NADPH Standard |
Blank Control |
Test Sample |
Serial Dilutions*: 50 μL |
PBS: 50 μL |
50 μL |
注意:将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>100μM,浓度)可能由于NADPH传感器的过度氧化而导致信号降低。
4.在上清液中运行NADP / NADPH测定:
4.1将50μLNADPH反应混合物(来自步骤2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADPH测定体积为100μL/孔。
注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或~570 nm至~605 nm的吸光度比下观察吸光度的增加,以提高检测灵敏度。
注意1:对于NADP / NADPH比率测量,建议使用试剂盒15263。
注意2:对于基于细胞的NADP / NADPH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(Cat#20012)裂解细胞。
数据分析
空白孔中的吸光度(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。
注意:吸光度背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。
图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在白色/透明底96孔板中用Amplite™比色总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 在孵育1小时(n = 3)时可以检测到低至100nM(10pmol /孔)的NADPH,而NADH没有响应。
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
货号 | 15259 | 存储条件 | f/l |
规格 | 400 Tests | ||
Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 585 |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和NADP +是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。
现有的NADP / NADPH测定通过吸收在UV范围内进行。该测定具有低灵敏度和高干扰。这种Amplite™荧光总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH,其显着提高了检测灵敏度。此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显著降低了生物样品的干扰。无需从样品混合物中纯化NADP / NADPH。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。
Amplite™荧光总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析,可在100μL分析体积(10 nM;图1)中检测少至1皮摩尔的NADP(H)。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。红色发射时间越长,生物样品的自发荧光干扰越小。
产品说明书
96孔板测定示例
概述
准备NADP / NADPH反应混合物(50μL)
加入NADPH标准品或测试样品(50μL)
在室温下孵育15分钟–2小时
监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作方法
1.准备NADPH原液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。
注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物:
将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液(组分B)加入NADP / NADPH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至10μM):
3.1将10μLNADPH储备溶液(来自步骤1)加入990L PBS缓冲液中以产生10M(10pmol / L)NADPH标准溶液。
注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1:3连续稀释,得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。
3.3如表1和2中所述,将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。
表1.实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
||
NS3 |
NS3 |
||
NS4 |
NS4 |
||
NS5 |
NS5 |
||
NS6 |
NS6 |
||
NS7 |
NS7 |
注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。
表2.每个孔的试剂组成
NADPH Standard |
Blank Control |
Test Sample |
Serial Dilutions*: 50 μL |
PBS: 50 μL |
50 μL |
注意:将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>100μM,浓度)可能由于NADPH传感器(对非荧光产物)的过度氧化而导致荧光信号降低。
4.在上清液中运行NADP / NADPH测定:
4.1将50μLNADPH反应混合物(来自步骤2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADPH测定体积为100μL/孔
注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm(540 / 590nm)下用荧光板读数器监测荧光增加。
注意1:也可将板的内容物转移到白色透明底板上,用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。
注意2:对于NADP / NADPH比率测量,建议使用Cat#15264。
注意3:对于基于细胞的NADP / NADPH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(Cat#20012)裂解细胞。
数据分析
空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。
注意:荧光背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。
图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在黑色96孔板中用Amplite™荧光总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。在孵育30分钟(n = 3)时可以检测到低至10nM(1pmol /孔)的NADPH,而NADH没有响应。
上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品,欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
货号 | 15264 | 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 | |
规格 | 250 Tests | 价格 | 4584 | |
Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 585 | |
分子量 | 溶剂 | |||
产品详细介绍 |
简要概述
Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(荧光法)红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADP/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。 NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。
传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 这些方法具有低灵敏度和高干扰,因为测定是在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行的。 基于吸收的NADP / NADPH测定的低灵敏度使得测定难以自动化以进行通常使用小样品量的高通量筛选。
这种Amplite 荧光NADP / NADPH比率检测试剂盒为敏感检测NADP,NADPH及其比例提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶再循环反应中的NADP / NADPH,其显着提高了检测灵敏度。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显着降低了样品干扰。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可以通过荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm(最大Ex / Em = 540 / 590nm)或吸光度酶标仪在~576nm处容易地读取。 这也提供NADP,NADPH提取缓冲液和细胞裂解缓冲液。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的NADP/NADPH检测试剂盒。
适用仪器
光吸收酶标仪 | |
吸收: | 576 ± 5 nm |
推荐孔板: | 透明底板 |
荧光酶标仪 | |
激发: | 540nm |
发射: | 590nm |
cutoff: | 570nm |
推荐孔板: | 黑色孔板 |
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备NADPH标准品或测试样品(25μL)
在室温下加入25μLNADPH或NADP提取液孵育15分钟
加入25μLNADP或NADPH提取液(25μL)
加入NADP / NADPH反应混合物(75μL)孵育于 室温保持15分钟 – 2小时
监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADPH原液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。
注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物:
将10mL NADPH传感器缓冲液(组分B)加入NADP / NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至10μM):
3.1将10μL1mMNADPH储备溶液(来自步骤1)加入990μLPBS缓冲液(pH7.4)中,得到10μM(10pmol / L)NADPH标准溶液。
注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
3.2取200μL10M NADPH标准溶液(来自步骤3.1)进行1:3连续稀释,得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0 M系列稀释液。
3.3如表1和2中所述,将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见,NADP / NADPH裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。
表1.实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
TS (NADPH) |
TS (NADHP) |
TS (NADP) |
TS (NADP) |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
…. |
…. |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
|
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|
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NS3 |
NS3 |
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NS4 |
NS4 |
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NS5 |
NS5 |
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NS6 |
NS6 |
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|
NS7 |
NS7 |
|
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|
注意:NS = NADP / NADPH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS(NADPH)=用NADPH提取液处理10至15分钟的测试样品,然后用NADP提取溶液中和; TS(NADP)=用NADP提取溶液处理10至15分钟的测试样品,然后用NADPH提取溶液中和。
表2每个孔的试剂组成
NADPH Standard |
Blank Control |
Test Sample (NADP/NADPH) |
Test Sample (NADPH Extract) |
Test Sample (NADP Extract) |
Serial Dilutions*: 25 μL |
PBS: 25 μL |
Test Sample: 25 μL |
Test Sample: 25 μL |
Test Sample: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component D: 25 μL |
Component E: 25 μL |
Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes |
||||
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component E: 25 μL |
Component D: 25 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
*注意:将连续稀释的NADPH标准品(0.01μM至3μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>100μM,最终浓度)可能由于NADPH传感器(对非荧光产物)的过度氧化而导致荧光信号降低。
3.4对于NADPH提取(NADPH):将25μLNADPH提取溶液(组分D)加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后加入25μL的NADP提取溶液(组分E)以中和NADPH提取物,如表1和2中所述。
对于NADP提取(NADP):将25μLNAP提取溶液(组分E)加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后加入25μLNADPH提取溶液(组分D)以中和NADP提取物,如表1和2中所述。
对于总NAPD和NADPH:将25μLNADP/ NADPH对照溶液(组分F)加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟,然后如表1和2中所述添加25μL对照溶液(组分F)。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。 NADP / NADPH裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。
4.在上清液反应中运行NADP / NADPH测定:
4.1将75μLNADPH反应混合物(来自步骤2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤3.4)的每个孔中,以使总NADPH测定体积为150μL/孔。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。
注意:也可以将板的内容物转移到白色透明底板上,并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。
数据分析
空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 典型数据如图1所示(总NADP和NADPH对比NADP或NADPH提取物)。
图1.使用Gemini酶标仪(Molecular Devices),在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADP / NADPH比率测定试剂盒测量总NADPH和NADP及其提取物剂量响应。 用或不用NADPH或NADP提取溶液处理25μL等量的NADP和NADPH 15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。 在加入75μLNADPH反应混合物后30分钟,在Ex / Em = 540 / 590nm(在570nm处截止)获得信号。 从具有NADPH反应的那些孔的值中减去空白信号(注意:荧光背景随时间增加,因此重要的是减去每个数据点的空白孔的荧光强度值)。
试剂应用文献
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参考文献
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Journal: Cancer Research (2018): canres–2511
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Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
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