钙离子荧光探针Fluo-3FF,五钾盐

简要概述

      不渗透细胞的Fluo-3FF是Fluo-3的类似物，钙结合亲和力低得多，Kd〜10 µM。像Fluo-3一样，该指示剂基本上是无荧光的，但在结合钙时显示出强烈的荧光增强，并且没有光谱偏移。

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产品说明书

钙指示剂AM Esters的使用

1.带有钙指示剂AM酯：

      AM酯是非极性酯，很容易穿过活细胞膜，并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。AM酯被广泛用于无创地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须特别注意，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）进行重构。DMSO储备溶液应在-20°C的干燥环境中保存，并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯储备溶液。

b）在实验当天，将固体的钙指示剂溶解在DMSO中，或将等分的指示剂储备溶液解冻至室温。在您选择的含0.04％Pluronic®F-127的缓冲液（例如Hanks and Hepes缓冲液）中，准备2至20 µM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5 uM。必须根据经验确定细胞加载所需指示剂的确切浓度。为避免因过载和潜在的染料毒性而导致的任何伪影，建议使用可以产生足够信号强度的 小探针浓度。

c）如果您的细胞（例如CHO细胞）中含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺舒（2–5 mM）或亚砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（ 终孔浓度为1）丙磺舒为-2.5 mM，亚磺酰吡嗪为0.1 -0.25 mM，以减少去酯化指示剂的泄漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）添加到细胞板中。

e）在温度或37°C下将染料加载板室孵育20分钟（尤其是Fluo-8 AM）至2小时，然后在室温下将板孵育30分钟。

注1：降低加载温度可能会减少指示器的分隔。

注2：将Cal-520 AM孵育2小时以上，对于某些细胞系会产生更好的信号强度。

f） 用HHBS或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以除去过量的探针。

g）在所需的Ex / Em波长下运行实验。

2.测量细胞内钙响应：

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca²⁺缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca²⁺水平。

钙离子荧光探针Fluo-8FF,钾盐

简要概述

        钙离子荧光探针Fluo-8FF,钾盐是美国AAT Bioquest生产的用于钙通量测定的试剂，钙测量对于许多生物学研究至关重要。在结合Ca2+后显示光谱响应的荧光探针使研究人员能够使用荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离Ca2+浓度的变化。在可见光激发钙指示剂中，Fluo-3和Fluo-4 常用。但是，Fluo-3 AM和Fluo-4 AM在酯酶水解后在活细胞中仅适度发荧光，并且需要苛刻的细胞加载条件才能 化其细胞钙反应。开发Fluo-8®染料可改善细胞负载和钙响应，同时保持便捷的Fluo-3和Fluo-4光谱波长（在〜490 nm处具有 激发和在〜520 nm处具有 发射）。Fluo-8®AM仅需要室温，而Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37℃的电池负载。此外，Fluo-8®的亮度是Fluo-4 AM的2倍，是Fluo-3 AM的4倍。AAT Bioquest提供了一套出色的Fluo-8®试剂，具有不同的钙结合亲和力（Fluo-8®：Kd = 389 nM； Fluo-8H：Kd = 232 nM； Fluo-8L：Kd = 1.86 µM； Fluo-8FF ：Kd = 10 µM）。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的钙离子荧光探针Fluo-8FF,钾盐。

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产品说明书

操作步骤

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

        AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应在使用前用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。 DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。

        以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南，实际情况应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.02％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备1至10μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的 终浓度为4-5 uM。 细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。 为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的 小探针浓度。

注意：非离子洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加钙指示剂AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以在细胞培养基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以减少脱酯化指标的泄漏。 在室温或37°C下用钙指示剂酯孵育细胞20分钟至1小时。

d）在HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如2.5mM丙磺舒，如果适用）中洗涤细胞1-2次以除去过量的探针。

e）在所需的Ex / Em波长下进行实验（见说明书中的表1）。

2.测量细胞内钙响应：

        为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：[Ca]_free = K_d[F – F_min]/F_max – F]

        其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。 解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca2 +结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca 2+缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2 +水平。 说明书中的表1列出了一些钙试剂的Kd值供您参考。