biosearchtech KASP 基因分型试验试剂盒

我们获得专有技术的基于PCR的KASP基因分型化学方法包括三个成分：样品DNA，KASP分析混合物和包含两个通用FRET卡盒的KASP Master混合物。

KASP试用套件包含

• 33个预稀释的DNA样品
• 2X KASP预混液
• 对照KASP测定混合物

从完成的KASP反应中读取荧光信号所需的全部是具有FRET功能的酶标仪或qPCR仪器。

KASP 基因分型试验试剂盒用户指南

本指南内容

1 简介

2 试剂盒内容物

3 进行 KASP 基因分型反应的实验程序

3.1 KASP 基因分型反应

3.2 试剂盒组装

3.3 KASP 基因分型混合物组装

3.4 实验程序

3.5 热循环条件

3.6 其他循环条件

 

4 订购信息

 

1. 简介

KASP™ 基因分型试验试剂盒作为使用 KASP 化学品的介绍提供。它使用户能够使用现有设备在自己的实验室中测试化学物质。

一般而言，任何能够在表 1 中波长处读取 FRET 的 qPCR 仪器或酶标仪均应与 KASP 兼容。

KASP 已在广泛的 qPCR 仪器上得到验证，包括：

• ABI 7500

• ABI 7300

• ABI 7900

• ABI ViiA7

• 罗氏 LC480

• Agilent Mx3000P/3005P

• illumina EcoRT

• BIO-RAD CFX

 

2. 试剂盒内容物

 

该试剂盒包含 KASP 基因分型检测试剂盒，包括检测混合物、主混合物和 DNA：

1. 1 x 96 孔微量滴定板，含 33 份 DNA 样品（和 3 份无模板对照），预稀释至适用于 KASP 基因分型反应的浓度范围。

2. 1 x 500µL 管的 2x 浓度的 KASP 主混合物（足以进行 100 次反应）

10µL）。

3. 1 x 管 KASP 测定混合物（72x 浓度）。

 

客户要求

1. 快速酶标仪（激发和发射详见表 1）

荧光团的值）

2. 一个预期用于客户基因分型过程类型的空 PCR 板

3. PCR 级水

4. 光学透明密封件。

 

荧光团	激发波长 (nm)	发射 (nm)
FAM	485	520
六角	535	556
肾	575	610

表 1：KASP 化学中使用的荧光团及其各自的激发和发射波长。

 

3. 进行 KASP 基因分型反应的实验程序

 

3.1 KASP 基因分型反应

使用以下试剂制备 KASP 反应：

• 2x KASP 预混液

• 72x KASP 分析混合物

• DNA 样品（提供正确浓度的样品 DNA，用于 2x 稀释）

• 必要时加水定容至终反应体积。

 

3.2 试剂盒组装

384 孔板的总反应体积需要 5µL，96 孔板的总反应体积需要 10µL。

表 2 是如何为 384 和 96 孔板形式的 KASP 构建 60 个反应的示例。这将使您能够为 33 个样本和 3 个无模板对照 (NTC) 制备足够的基因分型混合物，并提供额外的备用体积。

 

3.3 KASP 基因分型混合物组装

 

组分	60 次反应的湿 DNA 法 (µL)
板格式	384 孔板	96 孔板
2x KASP 预混液	150	300
分析混合液	4.2	8.4
水	N / A	N / A
总反应体积	5	10
总计	300	600

表 2：KASP 反应组件示例

 

3.4 实验程序

1. 解冻 KASP Master mix 和 KASP Assay mix 试管。涡旋每个试管，并在冰上储存。

2. 解冻 DNA 板。短暂涡旋并向下旋转微孔板。

3. 使用单通道或多通道移液器将 DNA 转移至空反应板（客户提供）。

– 对于 96 孔板：将提供的 5µL DNA 转移至各孔中。

– 对于 384 孔板：将提供的 2.5µL DNA 转移至各孔中。

4. 按照表 2 所述制备基因分型混合物 (2x KASP Master mix plus Assay mix)。向反应板中的每个 DNA 样品中加入所需量的基因分型混合物。该程序可使用单通道或多通道移液器。

– 对于 96 孔板：向各 DNA 样本中加入 5µL 制备的基因分型混合物。

– 对于 384 孔板：向各 DNA 样本中加入 2.5µL 制备的基因分型混合物。

5. 用光学透明密封件密封平板。

6. 将微孔板离心至少 550 次x g. 不要以比转子推荐的速度更快的速度旋转微孔板。

 

3.5 热循环条件

KASP 化学品可以与任何标准热循环仪一起使用。热循环条件详见表 3，请注意，使用了两步降落 PCR 方法，延伸和退火步骤合并为一个步骤。建议在分配 DNA 和基因分型混合物后尽快循环反应板。如果不可行，制备好的平板可在 4 ℃ 下储存长达 1 小时OC. 平板分装后应立即用光学透明密封件密封，以防止任何蒸发。

 

步骤	性状	温度	时间	每个步骤的循环次数
1	活化	94OC	15 min	1
2	变性	94OC	20 s	10 个周期
	退火/伸长率	61-55OC	60 s （下降 0.6OC/循环）
3	变性	94OC	20 s	26 个周期
	退火/伸长率	55OC	60 s

表 3：KASP 化学品的热循环条件

热循环后，读取微孔板。

请注意：所有平板的读数均应低于 40OC. 如果微孔板读数未低于 40OC，不可能分析基因分型数据。

3.6 其他循环条件

如果您尚未获得明确的基因分型簇，则应将平板热循环额外 3 个循环，并再次读取。回收条件请参见表 4。

步骤	温度	时间	每个步骤的循环次数
变性	94OC	20 s	3 个周期
退火/伸长率	57OC	60 s

表 4：KASP 化学品进一步热循环的条件

在获得紧密的基因分型簇之前，可以进行进一步的循环和读取。

图 1 图 2

X 轴上报告的 FAM 等位基因

 

图 1：说明三个清晰簇的基因分型图示例。FAM 等位基因在 X 轴上报告（蓝色数据点），HEX 等位基因在 Y 轴上报告（红色数据点）。绿色数据

点代表杂合子样本，黑色数据点为无模板对照 (NTC)。

图 2：指示 KASP 基因分型试验试剂盒 DNA 样本预期基因分型结果的 96 孔板布局图。

 

 

注：本方案适用于所有三个试验套件部件编号。三种试剂盒之间的仅有差异是 KASP 主混合物中被动参比染料 ROX 的浓度，其根据使用的酶标仪类型而变化

4. 订购信息

 

产品代码	性状
KBS-1014-104	标准 Rox 试验套件
KBS-1014-105	High Rox 试模套件
KBS-1014-106	低 Rox 试验套件