FITC-xtra 

简要概述

        FITC-xtra 是美国AAT Bioquest生产的荧光素，虽然FITC仍然是用于制备绿色荧光生物共轭物的流行的荧光标记染料，但是FITC存在某些限制，例如用于显微镜成像的严重光漂白和pH敏感荧光。与相应的FITC缀合物相比，用FITC-xtra制备的蛋白质缀合物是非常优越的。FITC-xtra结合物比FITC结合物明显更亮，并且更加光稳定。另外，FITC-xtra的荧光不受pH（4-10）的影响。这种pH不敏感性是对FITC的重大改进，FITC仅在pH大于9时才发出其荧光.FITC-xtra具有几乎相同FITC的光谱特性。此外，FITC-xtra在温和缀合条件下比FITC产生高得多的缀合产率。像5-FITC，FITC-xtra抗体缀合物具有理想地适合于488nm激光线的激发，使其成为相应的FITC标记的抗体缀合物的替代物。在测试的相同条件下，FITC-xtra抗体缀合物提供比相应的FITC标记的缀合物高得多的信号/背景比。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的FITC-xtra  

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产品说明书

实验方案

1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：

将100μL反应缓冲液（例如，1M碳酸钠溶液，pH~9.0）与900μL目标蛋白溶液（例如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml，如果可能）混合，得到1 mL蛋白标记储备液。 
注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液将pH调节至8.0-9.0的范围。 
注2： 应将蛋白质溶于pH7.2-7.4的1XPBS中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐。 
注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的不纯抗体或抗体不能很好地标记。硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去硫柳汞，以获得标记结果。 
注4：如果蛋白质浓度小于2mg / mL，则结合效率显着降低。为获得标记效率，建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
 
2.准备染料储备溶液（溶液B）：
将无水DMSO加入到FITC-xtra小瓶中以制备10-20mM储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。 

注：在开始缀合之前准备染料储备溶液（溶液B）。及时使用。染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。溶液B可以在不受光照和潮湿的情况下储存在冰箱中两周。避免冻融循环。
 
3.准备所需的蛋白质结合物： 
注：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质结合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定染料/蛋白质比率。通常，对于大多数染料 – 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。
 
3.1使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到蛋白质的小瓶中溶液（95μl溶液A），有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。 
注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10％。
3.2进行结合反应。在有效摇动下将适量的染料储备溶液（溶液B）加入到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中。继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
3.3重复＃3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1; 如果需要，分别为15：1和20：1。
3.4使用预制的旋转柱或其他技术纯化所需的缀合物。
3.5计算上述4种缀合物的染料/蛋白质比（DOS）（见下文）。