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Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 绿色荧光
简要概述
Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 绿色荧光是AAT Bioquest研发的用于检测半胱天冬酶活性的试剂盒。半胱天冬酶在细胞凋亡和细胞信号传导中起重要作用。 Caspase 3/7（CPP32 / apopain）的激活对于细胞凋亡的起始是重要的。 Caspase 3/7也被鉴定为药筛选靶标。半胱天冬酶抑制剂具有抗癌和其他药理学潜力。已经证明Caspase 3/7对肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物选择性。
我们的Amplite 荧光Caspase 3/7检测试剂盒使用（Z-DEVD）2 R110作为荧光指示剂，用于检测caspase 3/7活性。R110衍生的半胱天冬酶底物可能是用于荧光检测各种半胱天冬酶活性的敏感的指示剂。R110肽是无色和无荧光的。通过半胱天冬酶裂解R110肽产生强荧光R110，其可以在510-530nm下荧光测量，在488nm激发，这是常见的激发光源。半胱天冬酶诱导的R110水解的荧光增加与半胱天冬酶的活性成比例。
Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 绿色荧光可用于使用荧光酶标仪或荧光计连续测量细胞提取物和纯化酶制剂中半胱天冬酶3/7的活性。许多实验室已使用该试剂盒筛选aspase 3/7抑制剂。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的Caspase 检测试剂/试剂盒。
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产品说明书
96孔板的测定方案
概述
用测试化合物（100μL/ 96孔板或25μL/ 384孔板）
制备细胞体积的半胱天冬酶3/7测定溶液
在室温下孵育1小时
在Ex / Em = 490 / 525nm处监测荧光强度
操作方法
1.准备细胞：
1.1对于粘附细胞：在生长培养基中将细胞在20,000至80,000个细胞/孔/ 90L下过夜，96孔板或5,000至20,000个细胞/孔/ 20L，用于384孔板。
1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于培养基中，培养基浓度为80,000至200,000细胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D赖氨酸平板或20,000至50,000细胞/孔/ 20L用于384孔聚-D赖氨酸板。 在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。
注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的佳细胞密度。
2.准备库存解决方案：
2.1在使用前，在室温下使用组分A，B，C（如果需要，组分D和E）。
2.2如果需要，制备1mM Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO储备液：将100μLDMSO（未提供）直接加入到Ac-DEVD-CHO小瓶（组分D）中。 该抑制剂可用于确认荧光信号强度与Caspase 3/7样蛋白酶活性之间的相关性。
注意：应将未使用的抑制剂储备液等分并在-20°C下干燥储存。
3.准备Caspase 3/7检测溶液：
将50μL200X胱天蛋白酶3/7底物储备溶液（组分A）和100μL1MDTT溶液（组分C）加入10mL测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：50μL的200X caspase 3/7底物储备液足以进行100次测定，每次测定的反应体积为100μL。 未使用的200X caspase 3/7底物储备液应等分，在-20°C干燥储存，避光。
4.运行Caspase 3/7测定：
4.1通过将10μL10X测试化合物（96孔板）或5μL5X测试化合物（384-板）加入PBS或所需缓冲液中来处理细胞。 对于空白孔（没有细胞的培养基），加入相应量的化合物缓冲液。
4.2将细胞板在培养箱中孵育一段所需的时间（用喜树碱处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。
4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的半胱天冬酶3/7测定溶液（来自步骤3）。
4.4将板在室温下孵育至少1小时，避光。
注1：如果需要，在室温下加入测定溶液10分钟前，将1L Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO的1mM储备液（来自步骤2.2）加入选定的样品中，以确认Caspase 3 / 7个类似的活动。
注2：如果需要，通过将5mM R110标准品（组分E）稀释到生长培养基中制备R110标准曲线，得到系列稀释的R110标准品，范围为0-50M。将100μL连续稀释的R110标准品加入含有的孔中。 在测量荧光之前的任何时间，100μLCaspase3/7测定溶液。 该标准曲线可用于测定含有胱天蛋白酶3/7的反应中产生的产物的摩尔数。
4.5在制动器关闭的情况下，以800rpm离心细胞板（特别是对于非粘附细胞）2分钟。
4.6在Ex / Em = 490 / 525nm处观察荧光增加。
数据分析
从具有细胞的那些孔值中减去具有生长培养基的空白孔中的荧光。空白孔的背景荧光根据生长培养基或微量滴定板的来源而变化。
图1. Jurkat细胞中半胱天冬酶3/7活性的检测。 将Jurkat细胞在同一天以80,000个细胞/孔/ 90L接种在黑色壁/透明底96孔板中。 用或不用20μM喜树碱处理细胞5小时，和/或用5μM半胱天冬酶3/7抑制剂AC-DEVD-CHO处理细胞10分钟。 加入半胱天冬酶3/7测定溶液（100μL/孔）并在室温下温育1小时。 使用NOVOstar仪器（BMG Labtech）在Ex / Em = 490 / 525nm下测量荧光强度。