简要概述

Cell Meter 活细胞免洗胱天蛋白酶3/7成像试剂盒使用我们开发的可渗透细胞的荧光胱天蛋白酶底物ApoSight Green Caspase 3/7（荧光探针）直接检测活细胞中的胱天蛋白酶活性。 ApoSight Green Caspase 3/7底物由三个部分组成，包括a）荧光团，b）半胱天冬酶选择性肽片段（DEVD），以及c）细胞穿透部分。细胞穿透部分将探针带入活细胞。进入活细胞后，半胱天冬酶选择性肽片段被半胱天冬酶裂解以释放荧光团。恢复的荧光强度与要测量的胱天蛋白酶的活性直接相关。与活细胞中现有的半胱天冬酶测定相比，ApoSight Green Caspase 3/7底物更加稳定，方便和准确。 ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物释放出Ex / Em〜490/520 nm的荧光团。如NucView试剂所报道的，它不需要DNA相互作用即可发荧光。如FMK肽探针所报道的，它不抑制胱天蛋白酶活性。尽管胱天蛋白酶的荧光FMK肽抑制剂被广泛用于检测活细胞中的胱天蛋白酶活性，但是该技术有一些严重的局限性：a）FMK半胱天冬酶抑制剂具有很高的细胞毒性，因为FMK肽与活性胱天蛋白酶共价结合。 b）FMK肽与caspase的不可逆共价结合会抑制caspase活性，导致假阳性凋亡。 C）FMK分析具有极高的本底，并且需要大量洗涤，从而导低的通量。 d）FMK肽在水溶液中不稳定，必须立即使用。 Cell Meter 活细胞免洗Caspase 3/7成像试剂盒提供了优化的荧光成像测定法，用于检测caspase3 / 7活性。该检测可以使用96孔或384孔板进行实验，并易于适应自动化。

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适用仪器

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.使用96孔板的密度为5×10⁴至2×10⁵细胞/ 100 µL /孔的待测化合物制备细胞
2.加入等体积的ApoSight Caspase 3/7底物工作溶液
3.在5％CO₂培养箱中于37°C孵育60分钟
4.用HHBS洗涤细胞1-2次
5.使用带有530/30 nm滤波片（FITC通道）的流式细胞仪或带有FITC滤波片组的荧光显微镜分析细胞

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。

ApoSight Green Caspase 3/7底物储备液（200X）
在ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 µL DMSO，制成200X ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分试样，以避免重复的冻融循环。
 
2.工作溶液配置
ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液
通过将5 µL 200X ApoSight Green Caspase 3/7底物储备溶液与1 mL分析缓冲液（组分B）混合，制备ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液。
注意，100 µL ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液足以进行96孔板的10次检测
注意，实验前准备足够的ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液，并立即使用。

样品示例及操作

悬浮培养中诱导细胞凋亡的实例

1.用2μg/ mL喜树碱处理Jurkat细胞3小时
2.用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3-4小时
3.用4μg/ mL喜树碱处理HL-60细胞4小时
4.用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。
注意，应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导凋亡细胞密度。

荧光显微镜的样品方案

1.用5×10⁴至2×10⁵个细胞/ 100 µL /孔/ 96孔板的密度制备含待测化合物的细胞。
2.向细胞中加入等体积的Caspase 3/7底物工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板）。
3.在5％CO₂培养箱中于37°C孵育60分钟。
4.用HHBS或您选择的缓冲液洗涤细胞1-2次。
5.使用FITC滤波片组的荧光显微镜成像。

图示

图1.使用ApoSight 绿色胱天蛋白酶3/7底物检测Jurkat细胞中胱天蛋白酶3/7活性。将Jurkat细胞（200,000个细胞/孔/ 96孔板）用1μM星形孢菌素或DMSO处理4小时。将细胞与Caspase 3/7底物工作溶液在37°C下孵育1小时。使用FITC滤波片组，用荧光显微镜拍摄图像。