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Cell Meter 细胞凋亡和细胞坏死检测试剂盒 三色荧光
简要概述
Cell Meter 细胞凋亡和细胞坏死检测试剂盒 三色荧光是美国AAT Bioquest研发的用于细胞凋亡和坏死检测的试剂盒，该特定试剂盒旨在同时监测细胞凋亡，坏死和健康。细胞凋亡是一种自主细胞拆解的活跃程序化过程，可避免引发炎症。在细胞凋亡中，磷脂酰丝氨酸（PS）被转移到质膜的外部小叶。作为细胞凋亡的初始/中间阶段的通用指标，可以在观察到形态变化之前检测细胞表面上磷脂酰丝氨酸的出现。该试剂盒中使用的PS传感器在与膜PS结合后具有绿色荧光（Ex / Em = 490 / 525nm）。坏死已被描述为由于环境扰动导致的被动，意外细胞死亡，其中炎性细胞内容物不受控制地释放。如通过膜不可渗透的7-AAD（Ex / Em = 546 / 647nm）标记细胞核的能力所证明的，质膜完整性的丧失代表了证明晚期细胞凋亡和坏死的直接方法。此外，该试剂盒还提供活细胞质标记染料，CytoCalcein Violet 450（Ex / Em = 405/450 nm），用于标记活细胞的细胞质。该试剂盒经过优化，可用流式细胞仪或荧光显微镜同时检测细胞凋亡（绿色），坏死（绿色和/或红色）和健康细胞（蓝色）。金畔生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的细胞凋亡和坏死检测试剂盒。
产品说明书
样品分析方案
概述
用测试化合物（200μL/样品）制备细胞
添加Apopxin Green测定溶液
在室温下孵育30-60分钟
用流式细胞仪或荧光显微镜分析
在Ex / Em = 490 / 525nm（细胞凋亡），550 / 650nm（坏死）和405 / 450nm（健康细胞）
操作步骤
1.用Apopxin Green制备和孵育细胞：
1.1用测试化合物将细胞维持一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。
1.2离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。
1.3将细胞重悬于200μL测定缓冲液（组分B）中。
1.4将2μLApopxin Green（组分A）加入细胞中。
可选1：将1μL的200X 7-AAD（组分C）加入细胞中用于坏死细胞。
可选2：将100μLDMSO加入到CytoCalcein Violet 450（组分D）的小瓶中，得到200X CytoCalcein Violet 450原液，然后向细胞中加入1μL进行健康细胞染色。
1.5在室温下孵育30至60分钟（避光）。
1.6在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μL测定缓冲液（组分B）以增加体积（参见下面的步骤1.7）。
1.7使用流式细胞仪或荧光显微镜观察Ex / Em = 490 / 525nm处荧光强度的细胞凋亡，550 / 650nm处坏死，以及405/450nm处的健康细胞（参见下面的步骤2或3）。
2.使用流式细胞仪分析细胞：
使用FL1通道（Ex / Em = 490/525 nm）定量Apopxin Green结合，并在添加7-AAD时使用FL3通道（Ex / Em = 490/650 nm）测量细胞活力，和/或 当将CytoCalcein Violet 450加入细胞中时，使用Ex / Em = 405 / 450nm。
注意：Apopxin 与贴壁细胞结合的流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van Engelend等人（见参考文献1和2）。
3.使用荧光显微镜分析细胞：
3.1从步骤1.5中移取细胞悬液，用测定缓冲液冲洗1-2次，然后用测定缓冲液重悬细胞。将细胞添加到载玻片盖玻片或黑色墙壁/透明底96孔微孔板的载玻片上。
注意：对于贴壁细胞，建议直接在盖玻片（或黑墙/透明底96孔微孔板）上培养细胞。与Apopxin Green孵育（步骤1.5）后，用测定缓冲液冲洗1-2次，然后将测定缓冲液加回到盖玻片（或黑色壁/透明底96孔微孔板）中。在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。在与Apopxin Green温育后，细胞也可以固定在2％甲醛中，并在显微镜下观察。
3.2使用FITC通道在荧光显微镜下用Apopxin Green分析凋亡细胞。当添加7-AAD时使用德克萨斯红色通道测量细胞活力，和当将CytoCalcein Violet 450添加到细胞中时测量/或紫色通道。质膜上的绿色染色表明Apopxin Green与细胞表面的PS结合。
数据分析
在活的非凋亡细胞中，Apopxin Green检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。在凋亡细胞中，Apopxin Green与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的外部小叶上，导致染色强度增加。
图1.在Jurkat细胞中检测Apopxin Green与磷脂酰丝氨酸的结合活性。 A.在37℃，5％CO 2培养箱中不用（A.蓝色）或用1μM星形孢菌素（A.Red）处理Jurkat细胞5小时，然后加载Apopxin Green 30分钟。使用FL1通道，用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式细胞仪测量Apopxin Green的荧光强度。 B和C：荧光图像显示活细胞（蓝色，CytoCalcein Violet 450染色），细胞凋亡（绿色，Apopxin Green染色）和Jurkat细胞坏死（红色，7-AAD染色指示）用1μM星形孢菌素处理3小时。用Olympus荧光显微镜分别通过Violet，FITC和TRITC通道拍摄细胞的荧光图像。如上所示，合并来自相同细胞群的每个通道的各个图像。 B：非诱导对照细胞; C：星形孢菌素诱导的细胞的三重染色。