RiboLace Mod. 1–核糖体提取试剂盒

RiboLace Mod. 1–核糖体提取试剂盒

核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒(ribonucleoprotein particle),主要由RNA和蛋白质构成,其唯yi功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链,所以核糖体是细胞内蛋白质合成的分子机器。核糖体无膜结构,主要由蛋白质(40%)和RNA(60%)构成。核糖体按沉降系数分为两类,一类(70S)存在于细菌等原核生物中,另一类(80S)存在于真核细胞的细胞质中。

RiboLace Mod. 1核糖体提取试剂盒是一款由Immaginabiotechnology公司基于嘌呤霉素(嘌呤霉素是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构,能够同氨基酸结合,代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合)通过无抗体、无融合标签蛋白的Pull-Down技术来分离活性核糖体的试剂盒。

 

 

操作使用

 

实验流程图

 

(1)实验前准备

另外需自备的材料

10% 脱氧胆酸钠(DNase/RNase free water)

cycloheximide

RiboLock RNase抑制剂

SUPERase•In™ RNA酶抑制剂

RNA酶和DEPC水

酸酚氯仿混合液

Nanodrop ND-1000 UV-VIS分光光度计

糖原蓝色染料

异丙醇

微型离心机和无RNA酶微量离心管(0.2 mL和1.5 mL)

旋转器

用于1.5mL试管的磁力支架

 

a. 稀释RiboLace smart probe:在RiboLace smart probe中加入316.5 μL B-Buffer,然后在冰上解冻。使用后,建议将混合物等分,并储存于-80℃,避免两次以上的反复冻融。

b. 在裂解缓冲液Lysis Buffer使用前添加以下成分:脱氧胆酸钠(1 %终浓度)、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制剂。

(2)裂解

贴壁细胞裂解

a.裂解前,使用10 µg/mL的环己酰亚胺(CHX)在37℃下处理细胞5 min。我们建议使用70-80 %汇合的细胞。CHX处理可提高核糖体亲和纯化的效率,可选步骤。如果您使用的是人体或小鼠组织,请注意裂解缓冲液和W-缓冲液中都含有CHX(10 ng/mL)。

b.孵育后,将细胞置于冰上,并用含有CHX(20 µg/mL)的冷PBS快速洗涤。

c.用移液枪去除PBS

d.将加入了脱氧胆酸钠(1 %终浓度)、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制剂的裂解液加入细胞培养皿中进行裂解,并用力刮擦(适当的机械刮擦对有效裂解很重要)。

e.1.5 mL离心管中收集细胞裂解物,并在20000 g离心5 min。

f.将上清液转移到新的试管中,冰浴20 min

g.使用Nanodrop分光光度计,取1 µL细胞裂解液,检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度(设置Nanoddrop的“核酸”功能)

悬浮细胞裂解

a.裂解前,使用10 µg/mL的环己酰亚胺(CHX)在37℃下处理细胞5 min。我们建议使用70-80 %汇合的细胞。CHX处理可提高核糖体亲和纯化的效率,可选步骤。如果您使用的是人体或小鼠组织,请注意裂解缓冲液和W-缓冲液中都含有CHX(10 ng/mL)。

b.收集细胞,在4℃下以950 g离心5 min,弃培养基,用含有CHX的冷PBS(20 µg/mL)快速洗涤细胞。

c.收集并在4℃下以950 g离心5 min。除去上清液,并用加入了脱氧胆酸钠(1 %终浓度)、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制剂的裂解液将细胞重悬。

d.通过G26针(约10次)使细胞裂解而不产生气泡。

e.20000 g离心5 min。

f.将上清液转移到新的试管中,冰浴20 min

g.使用Nanodrop分光光度计,取1 µL细胞裂解液,检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度(设置Nanoddrop的“核酸”功能)

组织裂解

a. 用研钵和研杵在液氮下将纸巾碾碎。回收粉末于1.5 mL试管中

b. 10 mg组织加入800 µL 组织裂解液 (IMMAGINA cat. nr. #RL001-2),请注意裂解缓冲液和W-缓冲液中都含有CHX10 ng/mL)。

c. 20000 g离心2 min并收集上清液。

d. 再次以20000 g离心上清液5 min,并收集上清液,冰浴20 min。

e. 使用Nanodrop分光光度计,取1 µL细胞裂解液,检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度(设置Nanoddrop的“核酸”功能)

(3)磁珠处理

a. 从4°C下取出RiboLace磁珠,并将试管置于RT下至少30分钟。

b. 将RiboLace磁珠管涡旋30秒以上。

c. 加入90 µL RiboLace磁珠至新的1.5 mL试管中。最终体积=90 µL x N(N=样品数量),随后置于磁力架上,去除上清液。

d. 取下试管,用等体积(90 µL x N)的OH缓冲液洗涤RiboLace磁珠5分钟,然后弃掉上清液。

e. 向离心管中加入900 µL不含核酸酶的水洗涤磁珠。

f. 加入体积为(90 µL x N)的B-缓冲液洗涤珠子,3分钟,共两次。将试管放于磁力架上至少1分钟,然后弃上清液。

g. 加入(30 µL x N)体积的稀释的RiboLace smart probe,1400 RPM室温孵育1 h,注意不要让磁珠沉淀,在孵育期间,可以进行核酸酶处理的步骤。

h. 另取2 µL 已稀释的RiboLace smart probe保存于冰上,作为后续验证。

i. 孵育后,将试管放在磁力架上,留存3 µL上清液作为验证。

j. 向管中加入一定体积(3 µL x N)mPEG,在室温下在振荡器中混匀15 min。注意不要让磁珠沉淀。

k. 将试管置于磁力架上2-3 min,弃上清液,加入500 µL不含核酸酶的水洗涤。

l. 加入500 µL W缓冲液清洗磁珠,两次。

m. 加入200 µL的W缓冲液将RiboLace磁珠重新悬浮,并根据样品的(N)个数将结合的磁珠等分。注意不要让磁珠变干。

n. 结合效率的预估:将孵育后的上清液与未与磁珠孵育的RiboLace smart probe在270 nm(Nanodrop ND-1000)处的吸光度进行比较,可以估计磁珠结合效率(预计吸光度降低约10-50%)。

(4)核酸酶处理

a. 将W缓冲液加入总体积为0.1-0.3 A. U(260nm)的裂解液,至最终体积为150 µL。

b. 加入0.3 µL Stabilizing Nux Solution (SS),吸打混匀。

c. 取2 mL管,加入1.5 µL核酸酶(Nux),并加入98.5 µL W缓冲液(WB)。用移液枪吸打5次,使稀释的Nux溶液充分混匀。

d. 加入稀释的核酸酶(Nux)溶液于1.5 mL离心管中,25°C处理样品45 min,核酸酶(Nux)溶液使用体积(µL)为A.U x 5。

e. 加入0.5 µLSUPERase•In™ RNA酶抑制剂,冰浴10 min。

(5)核糖体Pull-Down

仅在添加细胞裂解液之前,去除W缓冲液(步骤3.m中)

a. 向步骤3.m中处理过的磁珠中加入处理过的细胞裂解液并充分混合。

b. 4°C,慢速(3 rpm)孵育70分钟。

c. 取出离心管,不要离心,置于冰浴的磁力架上,保持在冰上操作,分离磁珠。

注意不要将磁珠从磁力架上取下,也不要触摸磁珠。

d. 500 µL W缓冲液小心清洗磁珠两次。

e. 从磁力架上取下,并用200 µL W缓冲液将磁珠重悬。

f. 将磁珠悬浮液转移至新的不含核酸酶的1.5 mL离心管中。

(6)核糖体分离

a. 向磁珠悬浮液中加入20 µL 10%SDS和5 µL蛋白酶K,并在37°C水浴75 min。

b. 加入225 µL酸性苯酚、氯仿、异戊醇混合物。

c. 涡旋混匀,14000 g离心5 min。

d. 如果离心后没有分离,可加入20 µL 2 M NaCl(DEPC水),再次离心。

e. 保留水相并将其转移至新的瓶中。

f. 加入500 µL异丙醇和2 µL糖源蓝色染料。

g. 混合并室温孵育3 min,然后在-80°C下储存:

至少2小时或过夜。

h. 4°C下离心(20000 g)30 min。

i. 加入5 µL无核酸酶水将RNA沉淀重悬。

j. 使用PAGExt试剂盒(Cat. No ##KGE002_12)进行RPFs PAGE纯化。

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Immaginabiotechnology

RiboLace Mod. 1

#RL001_Mod. 1_12

12

上海金畔生物科技有限公司

 

常见问题

1. 在进行RiboLace Pull-Down之前,需要用环己酰亚胺处理细胞吗?

答:CHX(环己酰胺)存在于试剂盒中包含的裂解液(LB)以及W缓冲液(WB)中。RiboLace在使用或不使用环己酰亚胺的情况下都能很好地发挥作用。也就是说,细胞是否添加CHX处理取决于实验设置。一些客户在起始密码子周围发现了由于CHX引起的P位点周期性伪影。相反,CHX可以使核糖体保护片段的长度在28个核苷酸处向更均匀的峰值移动。根据我们的经验,20 µg/mL的CHX略微改善了P位点沿编码区的分辨率周期性。例如,从没有进行CHX处理的快速冷冻脑组织中获得了良好的P位点周期性。如果您的样品易流失核糖体,我们建议增加W缓冲液中的CHX浓度(目前为20 µg/mL,至40 µg/mL),并在每个W缓冲液中加入30 mL CHX储备溶液(10 mg/mL)。

 

2. 应该如何冷冻Ribolace实验的样品?

答:对于使用CHX裂解细胞,我们建议在进行RiboLace之前进行细胞裂解,并将其保存在-80的温度下,保存时间最多1-2个月。

对于不使用CHX裂解细胞,我们建议在进行RiboLace之前,快速冷冻并储存在-80℃下,最多1-2个月。

对于组织样品,我们建议在进行RiboLace之前,快速冷冻组织并将样品储存(-80℃)最多1-2个月。

 

3. 不能在一天内完成所有的步骤。处理过的磁珠可以储存并第二天继续吗?

答:是的,可以停止。我们建议将磁珠保持在含有RiboLace smart probe的溶液中,即在磁珠分离和加入mPEG之前。在室温1400 rpm孵育1 h后,可以将磁珠在4℃下储存过夜,不要冷冻。

 

4. RiboLace Mod. 1适用于哪些物种?

答:一般来说,RiboLace在真核细胞和组织上效果良好,截至目前,已在哺乳动物细胞、小鼠和昆虫组织中得到验证。

 

5. 试剂盒到货后有效期多久?

答:12个月

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