鸡脾脏淋巴细胞分离液试剂盒,索莱宝,P9120-200ml*3

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鸡脾脏淋巴细胞分离液试剂盒,索莱宝,P9120-200ml*3

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索莱宝

·  储存条件 : 18-25℃保存,有效期2

·  单位 : 盒

 

试剂盒组成:
全血及组织稀释液                200ml
细胞洗涤液                         200ml
鸡脾脏淋巴细胞分离液          200ml
说明书 1
本品用于分离鸡脾脏淋巴细胞。
本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启封后置常温保存。如 4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。

规格:4 ×200mL/kit
保存:室温避光储存,有效期至少2年。启封后置4℃保存,有效期一周。

一、 脾脏组织单细胞悬液的制备方法
注:A.全过程及所需试剂要求无菌环境。
B
.本试剂盒中不包含胶原酶,若采用酶消化法制备单细胞悬液,请用户根据各实验室要求另购不同类型胶原酶。
1.
剪碎法:将组织块放入平皿后,加入少量F液及20%胎牛血清;用眼科剪将组织剪至匀浆状,加入5mL F液及20%胎牛血清;用吸管吸取组织匀浆,用100目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内;离心沉淀1500/分×3 min,再用细胞清洗液清洗3次,每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片,以200目不锈钢滤网(另购)过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(25)×107/mL。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或样本稀释液悬起细胞浓度为2×108~1×109/mL的单细胞悬液备用。
2.
匀浆器法:用眼科剪将组织剪成小块;放入70mL组织研磨器内,加入2mLF液及20%胎牛血清;缓慢转动研棒,研磨至匀浆;用5mLF液及20%胎牛血清冲洗研器;收集细胞悬液,经200目不锈钢滤网(另购)过滤;离心沉淀800rpm×2min ,再用细胞清洗液洗3次,离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为(25)×107/mL。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或样本稀释液悬起细胞浓度为2×108~1×109/mL的单细胞悬液备用。
3.
酶消化法: 
A.用F液将胶原酶稀释,终浓度为400 U/mL,至于冰浴备用。 
B.取一适当大小培养皿进行操作:用镊子夹碎动物脾脏,加入稀释后的胶原酶,37℃消化20分钟。 
C.以100200目不锈钢滤网(另购)过滤,离心沉淀800prm×2min ,再用细胞清洗液洗3次,离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为(25)×107/mL。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或样本稀释液悬起细胞浓度为2×108~1×109/mL的单细胞悬液备用。
细胞计数方法: 
细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板(血球计数板)进行。既可用于分离(散)细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何,均须制备分散的细胞悬液。 
计数与计算过程 
1)在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。 
2)用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液,至盖玻片被液体充满为止。 
3)置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者,对于细胞团按单个细胞计数。 
4)按下式计数细胞悬液的密度: 细胞密度=(4个大格细胞总数/4)×104/mL×稀释倍数
公式中乘以104 因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm
(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 1mL1000mm3
细胞计数要点: 
A.进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104/mL,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;显微镜下计数时,遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分; 或细胞数<200/10mm2>500/10 mm2 时,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液。 
B.要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。 
C.取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确; 
D.数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计左线,不计右线。 
E. 操作时,注意盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
二、脾脏淋巴细胞分离方法
1
.取1mL脾脏细胞悬液(细胞浓度为2×108~1×109/mL)小心叠加在淋巴细胞分离液之上(比例为11),20℃±2℃,400g(约1500 /分),离心20 分钟(半径15cm 水平转子)。
2.  
此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层;为稀释液层。第二层;为环状乳白色淋巴细胞层。第三层;为透明分离液层。第四层;为红细胞层。收集第二层细胞放入含细胞清洗液4-5 毫升的试管中,充分混匀后,以500g(约1800 /分)离心20 分钟。沉淀经反复洗涤2 次即得所需淋巴细胞。
注: 提取率约为80%
三、 注意事项
1.
本分离液是敏光型的,在运输和贮藏过程中应在18-25℃避光保存,启封后置4℃保存避免微生物污染。另外,本品为真空包装,未启封前置于10℃ 以下易出现白色结晶,影响分离效果。
2.
待分离的组织要求新鲜,避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好,且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。
3.
由于各品牌离心机的性能不同,国内南北地区温度环境和四季的差异,可能影响分离效果,用户可以调节离心转数,调节离心的时间,摸索最佳的分离条件(具体分离条件各实验室自定)。
4.
最好使用无静电反应的离心管,推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。
四、产品性能指标
pH                             7.0-7.5
渗透压                         280-340mOsmol/kg
内毒素                         0.5EU/mL
无菌                           直接接种培养14 天后培养基澄清
澄明度及不溶性颗粒物           50mL 溶液中含10μm 以上的不溶性微粒20 粒以下,
25μm 以上的不溶性微粒5 粒以下

浓度
规格 200ml*3
保存 18-25℃保存,有效期2年